UHRF1表達下調對胃癌細胞增殖的抑制作用及機制

類維振，耿亞楠，韓東升，張偉，周林

（中國人民解放軍第八十八醫院，山東泰安271000）

UHRF1表達下調對胃癌細胞增殖的抑制作用及機制

類維振，耿亞楠，韓東升，張偉，周林

（中國人民解放軍第八十八醫院，山東泰安271000）

目的 探討泛素樣含PHD和環指域1（UHRF1）表達下調后對胃癌細胞增殖的抑制作用，并探討其作用機制。方法 將培養好的人胃癌細胞系（MKN45）隨機分為空白對照組、陰性對照組（shNC）和干擾組，后兩組分別感染病毒shNC、shUHRF1，采用短發夾RNA（shRNA）技術下調MKN45細胞中UHRF1表達，XTT法測定各組細胞生長情況，平板克隆形成試驗測算細胞克隆形成率，流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡率；裸鼠皮下成瘤試驗檢測細胞體內生長能力。結果 UHRF1表達下調后，MKN45細胞生長速度明顯下降、克隆形成減少（P均＜0.05）；干擾組G0／G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少（P均＜0.05），細胞凋亡率升高（P均＜0.05）；裸鼠皮下腫瘤生長速度下降（P＜0.01）。結論 下調UHRF1的表達能夠抑制胃癌細胞增殖，該作用可能通過延長細胞周期進程和誘導細胞凋亡來實現的。

胃腫瘤；泛素樣含PHD和環指域1；細胞增殖；細胞凋亡

胃癌是常見惡性腫瘤之一，包括中國在內的東亞地區是胃癌發病率和死亡率最高的地區［1］。胃癌的發生發展涉及多基因、多分子水平變化、多階段的一個復雜過程，而基因的表觀遺傳學修飾在其中發揮重要作用［2］。泛素樣含PHD和環指域1（UHRF1）作為重要的表觀遺傳學調節因子，參與DNA甲基化、細胞增殖和異染色質形成等過程［3］，并且在肝癌［4］、前列腺癌［5］和乳腺癌［6］等腫瘤中異常表達，與腫瘤形成密切相關。2014年6月～2015年12月，本研究通過分子生物學方法觀察UHRF1基因沉默對胃癌細胞增殖的抑制作用，并探討其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料 RPMI1640培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，RNA裂解液TRIzol購自美國Invitrogen公司；總蛋白提取試劑盒購自北京普利萊，UHRF1和β-actin抗體購自北京中杉金橋公司；UHRF1 shRNA及病毒由上海吉凱基因公司合成；XTT試劑盒購自羅氏公司；RT-PCR試劑盒購自大連Takala公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，熒光定量PCR分析儀7500購自美國ABI公司；Annexin V／碘化丙啶（propidiumiodide，PI）檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2細胞培養、分組及轉染 人胃癌細胞系（MKN45）來源于第四軍醫大學腫瘤生物學國家重點實驗室，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養液于37℃、5%CO2的孵箱中常規培養。利用GV209載體構建UHRF1短發夾RNA（shRNA）（shUHRF1）和陰性對照（shNC）的慢病毒載體，滴度測定為1× 109TU／mL。將MKN45細胞鋪于96孔板，隨機分為空白對照組、陰性對照組（shNC）和干擾組（shUHRF1），待陰性對照組和干擾組細胞生長至50%時按病毒滴度10、50、100、200分別進行病毒感染，12 h后更換培養液，3 d后熒光顯微鏡下通過綠色熒光觀察病毒感染情況。接著收集病毒滴度100、200的細胞進行擴大培養，流式細胞儀分選帶有綠色熒光的細胞，進行后續實驗。空白對照組不接受任何干擾。

1.3病毒感染后細胞中UHRF1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。裂解各組細胞后提取總蛋白，配制12%分離膠及5%積層膠，上樣，電流恒定20 mA進行SDS-PAGE電泳50 min，用半干法轉膜17 min（電壓恒定20 V），5%脫脂奶粉于室溫封閉20 min，2%脫脂奶粉稀釋一抗（鼠抗人UHRF1單克隆抗體1∶400），4℃冰箱內孵育過夜。TBST洗滌，2%脫脂奶粉稀釋HRP標記的二抗（羊抗鼠，1∶2 000），于室溫孵育1～1.5 h，TBST洗滌，ECL顯色，凝膠成像儀拍照（Biorad），QuantityOne軟件進行定量分析，以空白對照組為參照，計算其他各組UHRF1蛋白相對表達量。

1.4細胞生長情況測定 采用XTT法。將各組細胞以1×103個／孔接種于96孔培養板，每組設5個復孔，共接種7塊板，常規培養7 d，每天取出1塊板進行檢測。檢測前將XTT標記試劑（最終濃度為0.3 mg／mL）和電子偶聯試劑（PMS，N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸鹽）混合，每孔加入50 μL配好的混合液，與細胞共培養6 h，于酶標儀波長466 nm處檢測吸光度值，對照波長為650 nm，由此繪制各組細胞生長曲線，以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標。

1.5細胞克隆形成率測算 采用平板克隆形成試驗。各組細胞按1×103個／孔接種于90 mm2培養皿內，培養2周后，待形成肉眼可見的集落時終止培養，PBS清洗3遍，甲醇固定15 min，用0.1%結晶紫溶液染色20 min，流水緩慢沖洗后晾干，計數細胞克隆數量，計算克隆形成率。

1.6細胞周期和凋亡檢測 采用流式細胞術。收集各組細胞，調整細胞密度為1×106個／mL，用70%冰乙醇溶液固定。檢測前PBS洗滌1次，加入含RNA酶的碘化丙啶，避光溫育30 min后，流式細胞儀檢測細胞周期，計算各周期細胞百分比及細胞凋亡率。實驗重復3次取平均值。

1.7裸鼠皮下成瘤試驗 BALB／C裸小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，4～6周齡，17～21 g，均為雌性。寄養在動物中心，選擇恒溫25～28℃、恒濕45%～50%的半屏障系統環境下飼養。裸鼠攝入的飼料和水均需滅菌處理。取對數生長期的MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1細胞，消化計數并調整細胞濃度至1×107／mL，用注射器抽取MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1細胞懸液分別注入裸鼠尾右側和左側后背，每點0.2 mL（含活細胞數2×106個）。每次取5只裸鼠，實驗重復3次。每2天測量腫瘤1次，體積＝（D×d2）／2，其中D為最長直徑，d為最短直徑。4周后處死裸鼠，稱量腫瘤質量。

1.8統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組UHRF1蛋白表達 空白對照組、陰性對照組和干擾組UHRF1蛋白相對表達量分別為1.00 ±0.00、1.05±0.13、0.09±0.01，與其他兩組比較，shUHRF1組UHRF1蛋白表達降低（P均＜0.05）。

2.2下調UHRF1表達對MKN45細胞增殖、凋亡的影響 見圖1、表1。

2.3下調UHRF1表達對MKN45體內成瘤能力的影響 將MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1細胞分別注射于裸鼠兩側皮下，經過4周觀察后發現：注射MKN45-shUHRF1細胞的瘤體生長速度慢于注射MKN45-shNC細胞的瘤體；4周后同一只裸鼠MKN45-shNC側瘤體體積明顯大于MKN45-shUHRF1側，兩組瘤體的質量分別為（1.07±0.26）、（0.48±0.18）g，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1　MKN45細胞生長曲線

表1　下調UHRF1表達對MKN45細胞增殖、凋亡的影響（%±s）

表1　下調UHRF1表達對MKN45細胞增殖、凋亡的影響（%±s）

注：與干擾組比較，*P＜0.05。

組別細胞克隆形成率G0／G1期細胞S 期細胞細胞凋亡率空白對照組100±0*50.34±5.03*30.31±2.06*6.53±1.85*陰性對照組96±11*49.98±4.61*30.01±2.72*7.69±1.62*干擾組54±1168.46±3.0619.27±1.6413.94±2.06

3　討論

UHRF1是UHRF超家族成員之一，又稱ICBP90，包含N端泛素樣結構域UBL、植物同源性PHD結構域、SRA結構域和C端的環狀RING結構域的蛋白質，可與DNA甲基轉移酶、組蛋白去乙酰化酶及組蛋白甲基轉移酶相互作用，實現對DNA甲基化、組蛋白乙酰化及組蛋白甲基化的調控，從而參與細胞增殖、周期轉換及DNA損傷修復等生物學過程，是一種重要的表觀遺傳調控因子［7］。研究發現抑制UHRF1表達可增強和恢復抑癌基因的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡［8］。Unoki等［9］研究發現，E2F-1調控UHRF1促進細胞G1／S期轉換。UHRF1在肝癌［4］、乳腺癌［8］和膀胱癌［10］等腫瘤中異常高表達，在癌旁組織中的表達低于癌組織。證實了UHRF1在DNA甲基化、促細胞增殖和抗凋亡以及腫瘤發生發展中發揮重要作用。

本課題組前期通過免疫組織化學方法發現，胃癌組織中UHRF1表達顯著高于癌旁組織，其表達與胃癌分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移密切相關，而與患者年齡和性別無關，并且UHRF1表達強度可以作為胃癌患者預后的重要指標［11］。該結果初步提示了UHRF1在胃癌的發生發展中發揮重要作用，是一種潛在的癌基因。本研究首先通過RT-PCR法檢測發現胃癌組織中的UHRF1表達遠高于癌旁組織，然后通過shRNA技術下調MKN45細胞中的UHRF1表達后，細胞生長速度顯著下降，其中G0／G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少，從而特異性地抑制了細胞分裂，使細胞增殖速度減慢，并且能夠促進細胞凋亡。研究表明，UHRF1在維持DNA甲基化包括腫瘤抑癌基因的啟動子甲基化方面非常重要，如果這種維持作用被破壞，各種基因的隨機表達將被觸發，細胞內的穩態失衡，導致細胞凋亡或者細胞周期阻滯［12］。

綜上所述，下調UHRF1的表達可促進胃癌細胞凋亡、延長細胞周期進程從而抑制胃癌細胞生長。這一發現有助于進一步闡明胃癌的發生機制，并可望為胃癌防治提供新的靶標。

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Inhibitory effect of down-regulated expression of UHRF1
on cell proliferation of gastric cancer

LEI Weizhen，GENG Yanan，HAN Dongsheng，ZHANG Wei，ZHOU Lin
（1 The 88th Hospital of PLA，Taian 271000，China）

Objective To investigate the inhibitory effect of down-regulated expression of ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1（UHRF1）on cell proliferation of gastric cancer（GC）and to explore its mechanism.Methods The gastric cancer cell line（MKN45）were randomly divided into the blank control group，the negative control group（shNC group）and the interference group（shUHRF1 group）；the latter two group were infected with shNC and shUHRF1.After UHRF1 expression was down-regulated by shRNA in MKN45 cells，the cell growth was examined by XTT and the clone formation rate was calculated by plate clone formation assay.Cell cycle and apoptosis of MKN45 cells were detected by flow cytometry（FCM）.In vivo tumorigenicity assay was conducted to examine growth ability in vivo.Results After UHRF1 expression was down-regulated in MKN45 cells by shRNA，the cell growth significantly decreased and colony formation reduced（all P＜0.05）.In the shUHRF1 group，the proportion of cells in G0／G1 phase increased and in S phase decreased，the apoptosis rate was increased and the difference was statistically significant（all P＜0.05）.The tumor growth rate in nude mice was significantly decreased（P＜0.01）.Conclusion The down-regulation of UHRF1 expression may inhibit the proliferation of gastric cancer possibly through extending the cell cycle progression and inducing cell apoptosis.

gastric neoplasms；ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1；cell proliferation；apoptosis

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.003

R735.2

A

1002-266X（2016）21-0007-03

國家自然科學基金資助項目（81402337）。

類維振（1987-），男，護師，本科，主要研究方向為胃癌的增殖與轉移機制。E-mail：122238256＠qq.com

簡介：周林（1988-），男，主治醫師，博士，主要研究方向為胃腸道腫瘤的基礎與臨床。E-mail：zhoulin1105＠163.com

（2016-02-16）