西沙必利灌胃對氯吡格雷致大鼠胃黏膜損傷的干預作用及機制

張靜，陶磊，張子軒，榮峰

（1安徽醫科大學附屬六安醫院，安徽六安237005；2皖西衛生職業學院）

西沙必利灌胃對氯吡格雷致大鼠胃黏膜損傷的干預作用及機制

張靜1，陶磊2，張子軒2，榮峰2

（1安徽醫科大學附屬六安醫院，安徽六安237005；2皖西衛生職業學院）

目的 觀察氯吡格雷對大鼠胃黏膜的損傷作用，并探討西沙必利對黏膜損傷的影響及機制。方法 選取胃潰瘍模型制作后潰瘍完全愈合大鼠48只，隨機分為對照組、氯吡格雷組、西沙必利0.5 mg／kg組、西沙必利0.75 mg／kg組，每組12只。西沙必利兩組分別給予0.5、0.75 mg／kg西沙必利灌胃，1 h后與氯吡格雷組大鼠同時再予8.0 mg／kg氯吡格雷灌胃，之后禁食6 h；對照組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，連續灌胃30 d。觀察胃黏膜的病理變化，計算潰瘍復發率、胃黏膜損傷指數評分和上皮細胞凋亡率；Western blotting法檢測胃黏膜組織Caspase-3、NF-κB、Occludin、ZO-1、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白表達。結果 與對照組比較，氯吡格雷組潰瘍復發率、胃黏膜損傷指數評分和上皮細胞凋亡率升高，Caspase-3、NF-κB、p-p38、p-ERK蛋白表達水平上調，Occludin、ZO-1表達水平下降，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。與氯吡格雷組比較，西沙必利兩組潰瘍復發率、胃黏膜損傷指數評分和上皮細胞凋亡率降低，Caspase-3、NF-κB、p-p38、p-ERK蛋白表達水平下調，Occludin、ZO-1表達水平上升，差異有統計學意義（P均＜0.05）。結論 氯吡格雷可致大鼠胃黏膜損傷，西沙必利可抵抗該損傷，其機制可能與p38、ERK蛋白的磷酸化有關。

胃潰瘍；西沙必利；氯吡格雷；緊密連接蛋白；細胞凋亡

氯吡格雷屬于抗血小板藥物，臨床廣泛用于治療缺血性心腦血管疾病，但其引發的胃腸道損傷不良反應發生率較高［1，2］。目前，臨床常聯合使用質子泵抑制劑預防氯吡格雷引發的胃腸道損傷，但質子泵抑制劑會增加急性冠狀動脈綜合征患者死亡的危險［3，4］。研究報道，非選擇性5-羥色胺4（5-HT4）受體激動劑西沙必利具有胃黏膜保護作用，但其具體機制還不明確［5，6］。2014年2月～2015年3月，我們對此問題進行了研究。

1　材料與方法

1.1材料 健康雄性清潔級SD大鼠66只，購自安徽醫科大學實驗動物中心；Caspase-3、NF-κB抗體購自Abcam公司；ZO-1抗體購自Santa Cruz公司；Occludin、p-p38、p-ERK、p-JNK購自Cell Signal Technology公司；BCA蛋白定量測定試劑盒、ECL發光液購自ThermoFisher Scientific公司；羊抗鼠、羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；氯吡格雷片為賽諾菲（杭州）制藥有限公司產品；西沙必利片為浙江京新藥業股份有限公司產品；羧甲基纖維素鈉購自山東聊城阿華制藥有限公司。

1.2胃潰瘍模型建立及分組 實驗操作遵循《實驗動物學》有關規定，實驗設計及實施均經過本院動物倫理委員會審核批準。大鼠術前均禁食24 h，乙醚麻醉后開腹，將內徑為6 mm的塑料管緊貼于胃體與幽門交界處的漿膜面注入乙酸，25 s后移除，縫合手術切口。胃潰瘍模型制作后的第3、15、25天，同一時間點開始禁食24 h，禁食后處死，每次6只，觀察潰瘍愈合情況及測量潰瘍面積。在第26天證實潰瘍完全愈合的基礎上，將剩余大鼠隨機分為對照組、氯吡格雷組、0.5 mg／kg西沙必利組、0.75 mg／kg西沙必利組，每組12只。用0.5%羧甲基纖維素鈉分別溶解氯吡格雷和西沙必利。對照組給予0.5%羧甲基纖維素鈉（10 mL／kg）灌胃后禁食7 h。氯吡格雷組給予氯吡格雷（8.0 mg／kg）灌胃后禁食7 h。西沙必利預處理組分別先予0.5、0.75 mg／kg西沙必利灌胃，1 h后再予氯吡格雷（8.0 mg／kg）灌胃，之后禁食6 h。連續灌胃30 d，每次灌胃前禁食4 h。給藥結束后處死所有大鼠，觀察潰瘍復發情況，并采集標本進行后續各項指標的檢測。

1.3胃黏膜損傷評價 ①潰瘍面積測定：沿胃大彎切開胃，用0.9%氯化鈉溶液沖洗，將潰瘍輪廓描記在透明膠片上，復制到方格紙上，計算面積。②胃黏膜損傷指數評分：斑點樣損傷計1分，損傷長度＜1 mm計2分，1～＜2 mm計3分，2～＜4 mm計4分，≥4 mm計5分；若寬度≥2 mm，積分加倍計算。③組織染色觀察：胃組織用4%甲醛固定24 h，脫水，透明，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，400倍光學顯微鏡下觀察。④胃黏膜上皮細胞凋亡檢測：石蠟切片脫蠟，水化，加蛋白酶37℃消化30 min，加0.3%H2O2-甲醇室溫下作用10 min，加0.1%聚乙二醇辛基苯基醚冰上作用2 min，加50 μL反應混合液，37℃孵育60 min，加過氧化物酶于37℃作用30 min，加二氨基聯苯胺室溫顯色10 min，脫水，透明，封固。每例觀察5個視野，以每100個細胞中棕黃色陽性細胞所占比例作為凋亡率。

1.4胃黏膜組織中各類蛋白表達檢測 取各組大鼠胃黏膜組織，加組織裂解液裂解完全，蛋白樣品采用BCA法定量，上樣量為30 μg；經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離后，恒流轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜，之后加入相應的一抗（1∶1 000）、二抗（1∶5 000）進行孵育并洗膜，ECL發光顯影。采用Western blotting法檢測胃黏膜組織Caspase-3、NF-κB、Occludin、ZO-1、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白表達，計算其相對表達量。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組潰瘍愈合情況 乙酸潰瘍模型制作后第4、16、26天，各隨機選取6只大鼠處死觀察，胃潰瘍愈合依次為0、3、6只，潰瘍面積分別為（20.7± 1.5）、（4.5±0.8）、（0.0±0.0）mm2。

2.2各組給藥后潰瘍復發、胃黏膜損傷和上皮細胞凋亡情況 氯吡格雷組與0.75 mg／kg西沙必利組各死亡1只。對照組、氯吡格雷組、西沙必利0.5 mg／kg組、西沙必利0.75 mg／kg組潰瘍復發率分別為0、36.4%、16.7%、18.2%。與對照組比較，氯吡格雷組胃潰瘍復發率升高（P＜0.05）；與氯吡格雷組比較，西沙必利兩組胃潰瘍復發率均降低（P均＜0.05）。各組胃黏膜損傷和上皮細胞凋亡情況比較見表1。

表1　各組胃黏膜損傷及上皮細胞凋亡情況比較（±s）

表1　各組胃黏膜損傷及上皮細胞凋亡情況比較（±s）

注：與對照組比較，＃P＜0.05；與氯吡格雷組比較，*P＜0.05。

組別n胃黏膜損傷指數評分（分）上皮細胞凋亡率（%）對照組120.00±0.002.16±1.02氯吡格雷組1125.35±3.08＃36.35±6.72＃西沙必利0.5 mg／kg組1213.62±2.13*12.83±2.68*西沙必利0.75 mg／kg組1114.03±2.24*13.54±2.19*

2.3各組胃黏膜組織學變化 對照組大鼠胃腺部黏膜層、黏膜下層、肌層結構完整連續，腺體排列緊密，未見炎性細胞浸潤；氯吡格雷組大鼠潰瘍呈噴口狀，未見深達黏膜肌層，局部可見壞死組織，毛細血管廣泛充血擴張，黏膜層和黏膜下層均可見出血，并可見中性粒細胞浸潤及水腫改變；西沙必利兩組大鼠噴口狀壞死灶明顯減少、變淺，黏膜下層充血水腫減輕。

2.4各組胃黏膜組織各類蛋白表達 見表2。

表2　各組胃黏膜組織各類蛋白表達比較（±s）

表2　各組胃黏膜組織各類蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，＃P＜0.05；與氯吡格雷組比較，*P＜0.05。

組別nCaspase-3NF-κBOccludinZO-1p-p38p-ERKp-JNK對照組121.01±0.021.00±0.011.020±0.0211.004±0.0301.01±0.021.00±0.031.00±0.03氯吡格雷組112.05±0.24＃1.66±0.13＃0.326±0.005＃0.185±0.006＃1.94±0.15＃1.69±0.12＃1.12±0.02西沙必利0.5 mg／kg組121.26±0.13*1.42±0.11*0.672±0.014*0.364±0.013*1.22±0.09*1.16±0.07*1.21±0.05西沙必利0.75 mg／kg組111.14±0.15*1.03±0.02*0.581±0.012*0.309±0.017*1.28±0.08*1.08±0.04*1.03±0.03

3　討論

研究表明，既往潰瘍病史患者服用氯吡格雷易發生再出血，出血部位多為以往潰瘍發生處，內鏡下潰瘍已愈合者單獨服用氯吡格雷6個月后潰瘍的復發率達到11.0%［7］。氯吡格雷作為二磷酸腺苷受體拮抗劑，抑制血小板釋放內皮增生和加速修復潰瘍的血管內皮生長因子，可導致潰瘍組織血管生長受抑，從而延遲胃潰瘍的修復。氯吡格雷也可抑制人胃黏膜上皮細胞株GES-1的增殖，誘導細胞發生凋亡［8］。半夏瀉心湯可通過上調胃黏膜上皮細胞中B細胞淋巴瘤基因-2 mRNA的表達，下調活化的凋亡執行因子Caspase-3表達，從而抑制胃黏膜上皮細胞的過度凋亡發揮胃黏膜抗應激性損傷的作用［9］。本研究結果顯示，氯吡格雷使胃潰瘍愈合大鼠模型的潰瘍復發率上升，胃黏膜損傷指數及胃黏膜上皮細胞凋亡率升高，Caspase-3、NF-κB蛋白表達水平升高。

研究報道，5-HT4受體激動劑西沙比利可增加胃黏膜NO含量，擴張胃黏膜血管，加速損傷炎性因子的排除，抑制血小板聚集，促進HCO3-分泌，發揮胃黏膜的保護作用［5］。張連陽等［6］觀察西沙必利對大鼠出血性休克復蘇后胃損害的作用，結果顯示大鼠胃血流量下降幅度減少，胃黏膜丙二醛含量降低，Na+-K+-三磷酸腺苷酶活性增加，門靜脈血乳酸水平下降，西沙必利可有效改善復蘇后持續存在的胃缺血缺氧狀態。另一種5-HT4受體激動劑莫沙必利可減輕非甾體抗炎藥的促潰瘍作用，對胃黏膜發揮保護作用［10，11］。本研究結果顯示，與氯吡格雷組比較，西沙必利干預后大鼠胃潰瘍復發率、胃黏膜損傷指數評分和上皮細胞凋亡率明顯減小，Caspase-3、NF-κB蛋白表達水平下調，從而發揮抵抗氯吡格雷所致胃黏膜損傷的作用。

胃腸黏膜上皮屏障功能主要由細胞內緊密連接復合體維持，其中緊密連接蛋白主要包括跨膜蛋白Occludin、胞質附著蛋白ZO-1等［12］。Yang等［13］研究發現，腸黏膜中ZO-1和Occludin蛋白的表達明顯降低，腸黏膜通透性增強，導致腸道受損。Wu等［14］研究氯吡格雷對人胃黏膜上皮細胞株GES-1緊密連接蛋白表達的影響，結果顯示隨著氯吡格雷濃度的增加，ZO-1和Occludin蛋白的表達量呈降低趨勢，此過程p38／絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路處于激活狀態。MAPK在誘導細胞凋亡、應激及炎癥反應調控過程中發揮重要作用，參與調節胃上皮增生、分化、凋亡等過程，且與胃潰瘍形成具有緊密關系［15］。人類MAPK信號轉導通路主要由ERK、p38、JNK／MAPK這三個家族組成。高欣等［11］研究表明，莫沙必利對阿司匹林致大鼠急性胃黏膜損傷具有明顯保護作用，其機制可能為降低MAPKs信號通路中ERK和p38蛋白磷酸化程度，并上調胃黏膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達，從而改善胃黏膜屏障的功能。本研究發現，氯吡格雷可下調胃黏膜組織Occludin、ZO-1的表達水平，上調p38、ERK的磷酸化表達水平；經西沙必利干預后，Occludin、ZO-1的表達水平升高，p38、ERK的磷酸化表達水平下降。

綜上所述，西沙必利可通過減少胃上皮細胞凋亡、抑制潰瘍復發和上調胃黏膜Occludin、ZO-1表達水平，起到抵抗氯吡格雷所致大鼠胃黏膜損傷的作用，機制可能與p38、ERK的磷酸化有關。

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10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.011

R-332；R573

A

1002-266X（2016）21-0030-03

張靜（E-mail：wsry558＠126.com）

（2015-09-08）