糖尿病早期大鼠視網(wǎng)膜功能損傷及白藜蘆醇防護作用研究*

曾凱宏，王 元，鄧 波，余雪梅，宋 怡，周 雪，黃璐嬌

1.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 臨床營養(yǎng)科 (成都 610072)；2.電子科技大學 醫(yī)學院(成都 610054)

?

·論 著·

糖尿病早期大鼠視網(wǎng)膜功能損傷及白藜蘆醇防護作用研究*

曾凱宏1,2，王 元2，鄧 波1，余雪梅1，宋 怡1，周 雪1，黃璐嬌1

1.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 臨床營養(yǎng)科 (成都 610072)；2.電子科技大學 醫(yī)學院(成都 610054)

目的 探討糖尿病早期大鼠視網(wǎng)膜功能的損傷及白藜蘆醇的防護作用。方法 采用鏈脲佐菌素一次性腹腔注射SD大鼠建立大鼠糖尿病模型，隨機分為正常對照組和糖尿病組，低劑量(5 mg/kg/d)和高劑量(10 mg/kg/d)白藜蘆醇干預正常對照組和糖尿病組，分別在實驗1、3、5、7月測定視網(wǎng)膜電圖。結(jié)果 糖尿病早期視網(wǎng)膜scotopic 0.01 ERG b波振幅、scotopic 3.0 ERG a波和b波振幅、scotopic 3.0 OPS OP2潛時和振幅發(fā)生改變，低劑量和高劑量白藜蘆醇干預對上述視網(wǎng)膜功能損傷有明顯抑制效應(P<0.05)。結(jié)論 白藜蘆醇對糖尿病早期大鼠視網(wǎng)膜功能損傷有防護作用。

視網(wǎng)膜功能損傷；白藜蘆醇；糖尿病視網(wǎng)膜病變

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病的常見并發(fā)癥，是導致成人失明的主要原因。DR早期視網(wǎng)膜的改變主要包括：視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram, ERG) a波和b波的改變[1-2]、神經(jīng)細胞凋亡、膠質(zhì)細胞反應性增生和VEGF 的分泌增加等[3-6]。ERG是視網(wǎng)膜受到光刺激后從角膜紀錄到的一組視網(wǎng)膜電位變化，ERG的a波主要反映視網(wǎng)膜光感受器的變化，ERG的b波可能是來源于視網(wǎng)膜Müller細胞和雙極細胞的跨膜電流，主要反映視網(wǎng)膜內(nèi)核層的電活動。ERG的檢查對DR的早期改變是敏感的[7]。

白藜蘆醇(resveratrol, RSV)是一種具有延長壽命、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗血栓、保護心臟和保護血管等作用的多酚類植物抗菌素[8-10]，主要通過有效減少脂質(zhì)過氧化物和促炎癥細胞因子在體內(nèi)的含量，降低空腹血糖水平及細胞凋亡水平，增強機體抗氧化能力發(fā)揮其抗糖尿病作用[11]。近年來，RSV已被國內(nèi)外學者廣泛應用于糖尿病及其并發(fā)癥的研究中，但其對DR視網(wǎng)膜早期功能損傷的干預作用，至今仍鮮有報道。

本文采用鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導建立大鼠糖尿病模型，通過測定ERG研究RSV對糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜功能損傷的防護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級成年Sprague-Dawley(SD)大鼠購于四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所。

1.2 試劑及儀器

RSV純品和STZ購于美國Sigma公司，視網(wǎng)膜電圖儀由四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院“人類疾病基因研究四川省重點實驗室”提供。

1.3 糖尿病大鼠模型建立及實驗分組

實驗前大鼠禁食12 h，可自由飲水，以STZ誘導建立糖尿病大鼠動物模型，實驗前用0.1 mol/L(pH 4.2)的檸檬酸緩沖液配制成2 % STZ溶液，按60 mg/kg一次性左下腹腔注射STZ，于72 h后檢測定性尿糖和血糖，用尿糖試紙檢測尿糖達(+++)以上，尾靜脈采血測血糖濃度大于16.7 mmol/L即為模型建立成功。

實驗共分6組，分別為：正常對照組(CON)、糖尿病組(DM)，低劑量(5 mg/kg/d)和高劑量(10 mg/kg/d)RSV干預正常對照組(CON+L-RSV; CON+H-RSV)和糖尿病組(DM+L-RSV; DM + H-RSV)。

1.4 ERG檢測

分別在實驗1、3、5、7月對各組大鼠進行ERG測定。大鼠暗適應3 h以上，然后腹腔注射速眠新注射液進行麻醉。將麻醉狀態(tài)的大鼠固定于實驗臺上，左眼滴托品酰胺散瞳，尾部、左側(cè)頰部和左眼角膜表面分別安放接地電極、參考電極和記錄電極，并在角膜表面滴甲基纖維。參考電極和接地電極由不銹鋼針制成，記錄電極為0.2 mm銀-氯化銀制成的環(huán)形電極。采用視網(wǎng)膜電圖儀進行scotopic 0.01 ERG、scotopic 3.0 ERG、scotopic 3.0 OPS、Photopic 3.0 ERG和Photopic 3.0 Flicker Response測定。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 RSV對糖尿病大鼠一般情況、體質(zhì)量及血糖的影響

CON組、CON+L-RSV組及CON+H-RSV組大鼠每日飲水量、尿量正常，精神佳，對刺激敏感。與CON組大鼠相比，DM組大鼠出現(xiàn)明顯多飲、多尿、多食及消瘦，大便稀，毛無光澤污穢，精神差，生長慢，對刺激不敏感。與DM組大鼠相比，DM+L-RSV和DM+H-RSV大鼠上述表現(xiàn)明顯減輕， DM+H-RSV組比DM+L-RSV組作用更明顯。

整個實驗期間，CON組、CON+L-RSV組及CON+H-RSV組大鼠體質(zhì)量明顯增加，與CON組大鼠相比，DM組大鼠體質(zhì)量在整個實驗期間增加不明顯， DM+L-RSV組和高劑量DM+H-RSV組大鼠體質(zhì)量增加雖然比DM組明顯(P<0.05)，但與正常組相比，體重增加明顯低于CON組、CON+L-RSV組及CON+H-RSV組大鼠(P<0.05)(表1)。

整個實驗期間，CON組大鼠血糖始終維持在正常水平； DM組大鼠血糖明顯高于CON組， DM+L-RSV組和DM+H-RSV組大鼠血糖明顯低于DM組，但仍明顯高于CON組(P<0.05)(表1)。

2.2 RSV對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜功能損傷的防護作用

2.2.1 對Scotopic 0.01 ERG改變的防護作用 與CON組相比，DM組a波潛時、a波振幅、b波潛時在整個實驗期間無明顯改變。然而，DM組b波振幅在整個實驗期間明顯低于CON組，DM+L-RSV組和DM+H-RSV組b波振幅明顯增加，呈劑量效應關(guān)系(P<0.05)。CON+L-RSV組和CON+H-RSV組b波振幅與正常組比較無明顯差異(圖1)。

表1 RSV對糖尿病大鼠體質(zhì)量和血糖的影響

注：與CON組比較，aP<0.05；與DM組比較，bP<0.05

圖1 RSV對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Scotopic 0.01 ERG改變的影響

注：與CON組比較，***P<0.001；與DM組比較，#P<0.05；與DM組比較，###P<0.001

2.2.2 對Scotopic 3.0 ERG改變的防護作用 如圖2所示，a波、b波潛時在各組之間無明顯差異，DM組a波、b波振幅明顯低于CON組，DM+L-RSV組和DM+H-RSV組a波、b波振幅明顯增加，呈劑量效應關(guān)系(P<0.05)。CON+L-RSV組和CON+H-RSV組a波、b波振幅與正常組比較無明顯差異。

2.2.3 對Scotopic 3.0 OPS改變的防護效果 如圖3所示，與CON組相比， DM組OPS OP2潛時在各個時間點均明顯延長，DM+L-RSV組和DM+H-RSV組OPS OP2潛時明顯縮短，呈劑量效應關(guān)系(P<0.05)。CON+L-RSV組和CON+H-RSV組OPS OP2潛時與正常組比較無明顯差異。如圖4所示，DM組OPS OP2振幅明顯低于CON組，低劑量和高劑量RSV干預可明顯增加DM組OPS OP2振幅，呈劑量效應關(guān)系(P<0.05)。CON+L-RSV組和CON+H-RSV組OPS OP2振幅與正常組比較無明顯差異。

圖2 RSV對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Scotopic 3.0 ERG改變的影響

注：與CON組比較，***P<0.001；與DM組比較，#P<0.05；與DM組比較，###P<0.001

圖3 RSV對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Scotopic 3.0 OPS改變的影響

注：與CON組比較，***P<0.001；與DM組比較，###P<0.001

3 討論

糖尿病發(fā)展成DR是一個緩慢的過程，一般需要5～6年。糖尿病從明確診斷到眼底出現(xiàn)改變的階段被稱作DR的臨床前期。研究發(fā)現(xiàn)，DR的臨床前期是先有視網(wǎng)膜組織代謝損害，然后才出現(xiàn)組織學改變或眼底鏡下可見的血管異常改變。研究認為，視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元功能異常出現(xiàn)最早，ERG檢測對于DR的臨床前期視網(wǎng)膜神經(jīng)功能的改變非常敏感[7]。ERG是從視網(wǎng)膜的細胞水平評價視覺功能。大量研究發(fā)現(xiàn)，患糖尿病兩星期的大鼠，ERG的振幅比正常對照組低，對b波的影響較a波大。在1個月的糖尿病大鼠閃光ERG中，a波與b波的振幅均減少[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病早期視網(wǎng)膜scotopic 0.01 ERG b波振幅、scotopic 3.0 ERG a波和b波振幅、scotopic 3.0 OPS OP2潛時和振幅均發(fā)生不同程度的改變。

目前國內(nèi)外關(guān)于DR防護的多數(shù)研究證明，高級糖基化終產(chǎn)物抑制劑、蛋白激酶C抑制劑、腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑及一些抗氧化劑等對DR有防護效應，但對DR早期視損傷防護效果不明顯[12-13]。我們采用抗氧劑牛磺酸對DR早期RMCs損傷干預后發(fā)現(xiàn)，低濃度的牛磺酸干預對RMCs損傷基本沒有防護效應，高濃度牛磺酸干預對RMCs損傷雖有一定防護效應，但牛磺酸干預后DR早期患者視功能改善情況并不理想[6]。可能存在以下兩個原因：1)作用效力不夠；2)作用時間滯后。因而尋找更有效、更早期的抗早期DR損傷的措施十分必要。本研究采用抗氧化能力強的RSV干預糖尿病大鼠發(fā)現(xiàn)，低劑量和高劑量RSV干預對糖尿病早期大鼠視網(wǎng)膜功能損傷有明顯抑制效應，可能是今后防護DR早期功能損傷的有效手段。

[1]Wild S, Roglic G, Green A,etal. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030[J]. Diabetes Care, 2004, 27(5):1047-1053.

[2]Ginter E, Simko V. Global prevalence and future of diabetes mellitus[J]. Adv Exp Med Biol , 2012, 771:35-41.

[3]Maruthur N M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival[J]. Curr Diab Rep, 2013, 13(6):786-794.

[4]Ahsan H. Diabetic retinopathy-biomolecules and multiple pathophysiology[J]. Diabetes Metab Syndr, 2015, 9(1):51-54.

[5]Katsuda Y, Ohta T, Miyajima K,etal. Diabetic complications in obese type 2 diabetic rat models[J]. Exp Anim, 2014, 63(2):121-132.

[6]Zeng K, Xu H, Mi M,etal. Dietary taurine supplementa-tion prevents glial alterations in retina of diabetic rats[J]. Neurochem Res, 2009, 34(2):244-254.

[7]Ly A, Yee P, Vessey K A,etal. Early inner retinal astrocyte dysfunction during diabetes and development of hypoxia, retinalstress, and neuronal functional loss[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011, 52 (13):9316-9326.

[8]Nakata R, Takahashi S, Inoue H. Recent advances in the study on resveratrol[J]. Biol Pharm Bull, 2012, 35(3):273-279.

[9]Tennen R I, Michishita-Kioi E, Chua K F. Finding a target for resveratrol[J].Cell,2012, 148(3):387-389.

[10] Szkudelski T, Szkudelska K.Anti-diabetic effects of resveratrol[J].Ann N Y Acad Sci, 2011, 1215:34-39.

[11] Ku C R, Lee H J, Kim S K,etal.Resveratrol prevents streptozotocin-induced diabetes by inhibiting the apoptosis of pancreatic β-cell and the cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase[J]. Endocr J, 2012, 59(2):103-109.

[12] Abbate M, Cravedi P, Iliev I,etal. Prevention and treatment of diabetic retinopathy: evidence from clinical trials and perspectives[J]. Curr Diabetes Rev, 2011, 7(3):190-200.

[13] Zhu Y, Zhang X L, Zhu B F,etal. Effect of antioxidant N-acetylcysteine on diabetic retinopathy and expression of VEGF and ICAM-1 from retinal blood vessels of diabetic rats [J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(4):3727-3735.

A Study on the Early Retinal Dysfunction of Diabetic Rats and the Protective Effect of Resveratrol

Zeng Kaihong1,2, Wang Yuan2, Deng Bo1, Yu Xuemei1, Song Yi1, Zhou Xue1, Huang Lujiao1.

1. Department of Clinical Nutrition, Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People′s Hospital, Chengdu 610072, China; 2. School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610054, China

Objective To investigate the early retinal dysfunction of diabetic rats and the protective effect of resveratrol (RSV) on the retina of the diabetic rats. Methods The Sprague-Dawley rats were treated with a single intraperitoneal (i.p.) injection of streptozotocin (STZ) 60 mg/kg to establish the diabetic models. The rats were randomly divided into six groups as follows: normal control rats (CON); 5 mg/kg/day and 10 mg/kg/day RSV treated normal control rats (CON + L-RSV; CON + H-RSV); diabetic rats (DM); 5 mg/kg/day and 10 mg/kg/day RSV treated diabetic rats (DM + L-RSV; DM + H-RSV). The electroretinograms (ERGs) were used to measure the retinal functions of rats. Results The diabetes induced the changes in the amplitude of b-wave in scotopic 0.01 ERG and a- and b-wave in scotopic 3.0 ERG, and in the latency and amplitude of OP2 in oscillatory potentials. The resveratrol intervention of both low and high doses inhibited significantly the retinal dysfunction of diabetic rats (P<0.05). Conclusion Resveratrol has an inhibitory effect on the retinal dysfunction of diabetic rats.

Retinal dysfunction; Resveratrol; Diabetic retinopathy

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20150816.1125.004.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.001

國家自然科學基金項目(No:81202206)；四川省衛(wèi)生計生委項目(No:150216)

R587.1；R774.1

A