吉非替尼對非小細胞肺癌細胞PC-9增殖的抑制作用及其機制

吳海洪，李曉娟，莫少偉，莊麗穎

(海南省人民醫院，海口 570311)

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吉非替尼對非小細胞肺癌細胞PC-9增殖的抑制作用及其機制

吳海洪，李曉娟，莫少偉，莊麗穎

(海南省人民醫院，海口 570311)

目的 探討吉非替尼對非小細胞肺癌細胞PC-9增殖的抑制作用及其機制。方法 將生長狀態良好的PC-9細胞隨機分為四組，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予1、10、100 μmol/L吉非替尼干預8 h，對照組給予生理鹽水。采用MTT法檢測各組細胞增殖情況，實時熒光定量PCR法檢測細胞凋亡相關因子Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9 mRNA及MEK/ERK信號傳導通路相關因子Ras、Raf、MEK、ERK1/2 mRNA表達，免疫印跡法檢測細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl2、Caspase3和Caspase9及通路相關蛋白Ras、Raf、MEK及ERK1/2表達。結果 吉非替尼能夠抑制PC-9細胞增殖，且其抑制率隨著作用時間延長和作用濃度升高而提高(P均<0.01)；與對照組比較，低、中、高劑量組Ras、Raf、MEK、ERK1/2、Bcl2 mRNA及蛋白表達明顯降低，Bax、Caspase3、Caspase9 mRNA及蛋白表達明顯升高，且低、中、高劑量組組間兩兩比較均有統計學差異(P均<0.01)。結論 吉非替尼可抑制PC-9細胞增殖、促進其凋亡；其作用機制可能與抑制MEK/ERK信號轉導通路的激活有關。

非小細胞肺癌；細胞增殖；細胞凋亡；吉非替尼；細胞外信號調控激酶

近年來肺癌的發生率和病死率有逐年升高的趨勢[1～5]。目前非小細胞肺癌的發病機制尚不明確，且臨床上無特效治療藥物。吉非替尼是選擇性的表皮生長因子受體抑制劑，對來源于上皮的實體惡性腫瘤具有較好的療效[6]。2013年1月～2015年3月，我們觀察了吉非替尼對非小細胞肺癌細胞PC-9增殖的抑制作用，旨在為其臨床應用與新藥研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 PC-9細胞購自中國科學院上海細胞所；DMEM培養基購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；引物由上海生工協助合成；細胞培養板購自Gibico公司；胰蛋白酶購自Sigma Aldrich公司；兔抗Bax及Bcl2單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗Caspase3及Caspase9單克隆抗體購自美國R&D公司；兔抗Ras、Raf單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗MEK及ERK1/2單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；吉非替尼購自美國Sigma Aldrich公司；其余試劑為市售分析純。儀器：熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；全波長酶標儀購自美國Biotek公司；垂直蛋白電泳儀及轉膜系統購自美國ABI公司；高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司。

1.2 實驗分組及處理 PC-9細胞于5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養至生長狀態良好，將細胞隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組細胞數量1×106個。對照組給予生理鹽水，低劑量組給予1 μmol/L吉非替尼組培養8 h，中劑量組給予10 μmol/L吉非替尼培養8 h，高劑量組給予100 μmol/L吉非替尼培養8 h。

1.3 PC-9細胞增殖抑制率檢測 采用MTT法。將對數期生長的細胞經胰酶消化后用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基懸浮細胞，并接種于細胞培養板于CO2培養箱中培養。各組細胞恢復狀態后經相應濃度藥物處理后，棄去培養液并加入適量MTT繼續于適宜條件下培養。然后在細胞中加入二甲基亞砜并劇烈振蕩消化細胞，酶標儀檢測培養后細胞培養板各孔的吸光度值(OD值)。細胞增殖抑制率=(對照組OD值-試驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.4 細胞凋亡相關因子及MEK/ERK信號轉導通路相關因子mRNA檢測 采用熒光定量PCR法檢測細胞凋亡相關因子Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9 mRNA及MEK/ERK信號轉導通路相關因子Ras、Raf、MEK、ERK1/2 mRNA表達。mRNA提取制備及cDNA的逆轉錄合成過程均嚴格按照試劑盒說明書進行。熒光定量PCR的擴增條件為：95 ℃變性10 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共擴增35個循環。熒光定量PCR的反應體系為20 μL，其中cDNA模板2 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、2.5×SYBR Green(TianGen)8 μL、超純水9 μL。引物由上海生工合成。mRNA相對表達量以2-ΔΔCt表示，ΔCt=目的基因Ct-內參基因Ct。

1.5 細胞凋亡相關因子及MEK/ERK通路相關蛋白檢測 采用Western blottino法檢測細胞凋亡蛋白Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9及MEK/ERK信號轉導通路相關蛋白Ras、Raf、MEK及ERK1/2表達。將生長狀態良好的PC-9細胞經藥物處理后用冰冷的無菌PBS沖洗3次，每次10 min，按照試劑盒說明書提取總蛋白。各組細胞總蛋白提取后與5×SDS混合，并在沸水中煮沸5 min，作為樣品制備液。將等量的樣品制備液進行垂直的SDS-PAGE蛋白電泳(電泳條件：濃縮膠電壓維持70 V，分離膠電壓維持80～120 V)，電泳至溴酚藍移動到PAGE膠底部后停止。小心剝離PAGE膠后采用半干法轉膜轉至PVDF膜上(轉膜條件：電流300 mA，轉膜120 min)，用5%脫脂奶粉制備液在4 ℃條件下封閉1 h。將封閉過的纖維素膜與一抗(稀釋度為1∶200)在20 ℃條件下充分雜交240 min，PBS沖液漂洗(漂洗3次，每次10 min)；將與一抗雜交后的纖維素膜與二抗(1∶250)雜交，雜交時間為240 min。PVDF膜用無菌PBS漂洗3次后進行顯色、定影和拍照。蛋白相對表達量=靶蛋白表達量/內參β-actin表達量。

2 結果

2.1 各組不同時間點PC-9細胞增殖抑制率比較 見表1。

表1 各組不同時間點PC-9細胞增殖抑制率比較±s)

注：與低劑量組比較，*P<0.05，△P<0.01；與中劑量組比較，#P<0.01。

2.2 各組細胞凋亡相關因子及MEK/ERK通路相關因子mRNA相對表達量比較 見表2。

表2 各組細胞凋亡相關因子及MEK/ERK通路相關因子mRNA相對表達量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與低劑量組比較，#P<0.05，▲P<0.01；與中劑量組比較，●P<0.01。

2.3 各組細胞凋亡相關因子及MEK/ERK通路相關蛋白相對表達量比較 見表3。

表3 各組細胞凋亡相關因子及MEK/ERK通路相關蛋白相對表達量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與低劑量組比較，#P<0.05，▲P<0.01；與中劑量組比較，●P<0.01。

3 討論

ERK是目前最早發現的絲裂原活化蛋白激酶，該信號通路參與了幾乎所有細胞內的生理性及病理性過程，如生長、增殖、轉移、分化、發育及凋亡等[9]。MEK/ERK信號轉導通路是由一系列關鍵蛋白參與的，主要包括Ras、Raf、MEK及ERK等[10]。當細胞受到外部刺激后或外部細胞結合到細胞表面受體后，ERK信號轉導通路被激活或抑制，并調控細胞核內轉錄因子表達，進一步影響細胞的生理狀態。以往的研究證實，ERK信號轉導通路參與了腫瘤細胞的各種生理學過程，如增殖、分化、轉移、血管生成以及凋亡過程，并可作為腫瘤治療的靶點[11]。蔡巧等[12]研究發現，絲裂原活化蛋白激酶的激酶抑制劑CQN能夠在體外明顯抑制非小細胞肺癌細胞A549的增殖，且能夠濃度依賴性地抑制ERK1/2的磷酸化和促進細胞凋亡過程，表現出較強的體外抗腫瘤活性。以往的研究也發現抑制PI3K/AKT和MEK/ERK信號轉導通路均能抑制惡性腫瘤血管內皮細胞的水平、垂直和定向遷移，且其抑制作用具有濃度依賴性，同時，PI3K/AKT信號通路對內皮細胞遷移的影響比MEK/ERK信號通路明顯。在MEK抑制劑AZD8330對多發性骨髓瘤抗腫瘤作用的初步研究中也證實MEK抑制劑AZD8330可抑制骨髓瘤細胞NCI-H929和IM9增殖，使細胞周期阻滯于G1期，并促進細胞凋亡[13]。細胞凋亡是細胞的程序化的死亡過程，是維系細胞內環境穩定的重要過程，由一系列的細胞凋亡蛋白所介導，如Bax/Bcl2蛋白及Caspase蛋白家族[14,15]。上述細胞凋亡蛋白在多種抗腫瘤藥物抑制腫瘤的過程中均表現為激活或表達增強的狀態。正常生理狀態下的細胞中很少發生細胞凋亡過程，尤其是處于增殖過程的惡性腫瘤細胞的凋亡率較低。因此，促進細胞凋亡是抗腫瘤藥物發揮作用的重要機制。

吉非替尼是一種選擇性的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑[16]，臨床主要用于不適合化療的局部晚期或已經轉移的非小細胞肺癌患者。在EGFR基因突變及HER2/HER3蛋白表達水平與吉非替尼治療晚期非小細胞肺癌療效關系的研究中發現，對于中國人群，聯合檢測腫瘤組織中EGFR基因突變及HER2/HER3蛋白表達水平可預測吉非替尼對晚期非小細胞肺癌的療效[17]。在分析阿法替尼聯合西妥昔單抗治療非小細胞肺癌EGFR T790M突變所致的吉非替尼耐藥性的研究中也發現阿法替尼聯合西妥昔單抗對EGFRT790M突變所致耐藥的非小細胞肺癌原代細胞有效[18]。本研究發現，吉非替尼能夠抑制PC-9細胞增殖，且其抑制率隨著作用時間延長和作用濃度升高而提高；熒光定量PCR檢測發現吉非替尼能夠明顯增高細胞凋亡因子Bax、Caspase3和Caspase9 mRNA表達，降低Bcl2及MEK/ERK通路MEK及ERK1/2 mRNA表達；免疫印跡法檢測顯示吉非替尼能明顯增高細胞凋亡相關蛋白Bax、Caspase3和Caspase9，降低Bcl2及MEK/ERK通路Ras、Raf、MEK及ERK1/2蛋白表達。

綜上所述，吉非替尼可抑制非小細胞肺癌PC-9增殖，促進其凋亡；其作用機制可能是抑制MEK/ERK信號轉導通路的激活。

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