體外沖擊波療法聯合仙桃草口服用于兔橈骨骨不連臨床效果觀察

趙子星，李宏宇，席立成，郁少林，劉搏宇

(廣西壯族自治區人民醫院，南寧530021)

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體外沖擊波療法聯合仙桃草口服用于兔橈骨骨不連臨床效果觀察

趙子星，李宏宇，席立成，郁少林，劉搏宇

(廣西壯族自治區人民醫院，南寧530021)

目的 探討體外沖擊波療法(ESW)聯合中草藥仙桃草口服對橈骨骨不連的治療效果。方法 將120只橈骨骨不連兔按隨機數字表法分為聯合組、仙桃草組、ESW組和對照組，各30只。各組均予標準飼喂養1周。ESW組進行ESW治療1次；仙桃草組將1 g仙桃草磨成粉劑加入到60 g精飼料中，制成仙桃草混合飼料100 g，2次/d，共12周。聯合組行ESW聯合仙桃草混合飼料喂養，對照組不予特殊處理。各組于分組處理后48 h(T0)、1周(T1)、2周(T2)、4周(T3)、6周(T4)、12周(T5)，分別取5只大白兔行X線檢查，觀察其骨折愈合情況；處死動物，取骨痂組織，采用免疫組化法檢測骨形態發生蛋白2(BMP-2)、血管內皮生長因子(VEGF)。結果 隨時間延長，聯合組和ESW組骨痂逐漸增多，骨痂密度升高，骨不連處逐漸愈合，聯合組T2～T5時間點骨折愈合情況均優于ESW組；仙桃草組和對照組骨折間隙仍存在，骨折端仍為硬化骨，各時間點骨折愈合情況無明顯變化。與T0時間點比較，各組T1～T5時間點骨痂組織BMP-2、VEGF表達均升高(P均<0.05)。聯合組T1～T5時間點骨痂組織BMP-2、VEGF表達均高于其余各組，ESW組均高于仙桃草組、對照組(P均<0.05)。仙桃草組T1～T5時間點骨痂組織VEGF表達均高于對照組(P均<0.05)，BMP-2表達比較差異無統計學意義(P均>0.05)。結論 ESW聯合仙桃草口服對兔橈骨骨不連的愈合具有促進作用，其機制可能與上調骨痂組織BMP-2、VEGF表達有關。

骨不連，兔；體外沖擊波；仙桃草；骨形態發生蛋白2；血管內皮生長因子

骨組織具有強大的自身修復能力，但部分患者骨折后8個月仍不能愈合，而3個月無愈合傾向即稱為骨不連。目前臨床對骨不連多采用手術治療，但具有損傷大、費用高和需多次手術等缺點[1]。研究發現，體外沖擊波療法(ESW)能夠活躍成骨細胞，促進骨痂生成，特別是對于長骨骨不連的治療效果較好；中藥仙桃草亦具有一定的成骨作用[2]。2012年12月～2015年5月，本研究對大白兔橈骨骨不連模型采用ESW聯合仙桃草治療，取得較好效果。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性新西蘭大白兔120只，兔齡5～6個月，體質量3.0～3.5 kg，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。試劑與儀器：SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士物生物工程有限公司)；體外沖擊波碎石機(德國多尼爾醫療技術公司)，小型臺式離心機(I-13，美國Sigma公司)，數碼成像X線機(德國西門子公司)，光學顯微鏡(BX40，日本Olympus公司)，脫水機、石蠟切片機、包埋機、攤片機(德國Leica公司)。

1.2 模型制備與分組處理 120只大白兔標準飼料飼養1周后，制作兔橈骨骨不連模型：10%水合氯醛耳緣靜脈麻醉，截除右側橈骨中段1 cm，沖洗后填塞明膠海綿，逐層縫合。3個月后X線片檢查顯示骨折端硬化，骨折間隙清晰可見，表明骨不連模型制備成功。將120只橈骨骨折兔按隨機數字表法分為ESW組、仙桃草組、聯合組和對照組，各30只。分組后第1天ESW組行1次ESW治療：耳緣靜脈麻醉后，采用體外沖擊波碎石機分別于體外骨折遠、近端邊緣處行沖擊治療。設置參數：焦點能量0.5 mJ/mm2、頻率70～80次/min、沖擊量800次、焦點聚焦范圍1.5 cm2。仙桃草組行仙桃草混合飼料喂養：將1 g仙桃草磨成粉劑加入到60 g精飼料中，制成仙桃草混合飼料100 g，2次/d，共12周。聯合組參照上法給予ESW治療聯合仙桃草混合飼料喂養。對照組給予精飼料喂養，不予特殊處理。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 骨折愈合情況 各組處理48 h(T0)、1周(T1)、2周(T2)、4周(T3)、6周(T4)、12周(T5)分別取5只大白兔行X線檢查，觀察骨折愈合情況。

1.3.2 骨痂組織骨形態發生蛋白2(BMP-2)、血管內皮生長因子(VEGF)檢測 采用免疫組化法。各組觀察骨折愈合情況后以空氣栓塞法處死。取骨不連處長1.5～2.0 cm的骨痂組織，4%多聚甲醛溶液固定，10% EDTA脫鈣液脫鈣；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，HE染色處理，4 μm連續切片。石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2抗原修復，正常羊血清封閉，滴加BMP-2或VEGF單克隆抗體一抗和生物素標記的二抗；加入SABC液，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。Olympus光學顯微鏡下采用盲法觀察免疫組化切片，應用Imagepro Plus6.0圖像軟件對陽性反應細胞的平均光密度值(MOD)進行分析。

2 結果

2.1 各組骨折愈合情況比較 各組T0、T1時間點骨折愈合未見明顯變化。聯合組T2時間點骨折端有模糊骨痂影出現；T3時間點可見骨折間隙縮小，骨痂密度增高，呈云霧狀；T4時間點骨痂逐漸增多，骨痂密度較高，但骨紋理較亂；T5時間點骨痂較致密，外形趨于正常，骨紋理有規律的縱向排列，髓腔已通。ESW組T3時間點可見骨痂影，骨不連區間隙縮小；T4時間點骨痂明顯增多，骨痂密度高，骨痂影呈梭形，可見骨小梁；T5時間點骨痂密度進一步增高，骨小梁增多，排列較規律。聯合組各時間點骨折愈合情況均優于ESW組，而仙桃草組和對照組骨折間隙仍存在，骨折端仍為硬化骨，各時間點骨折愈合情況無明顯變化。

2.2 各組骨痂組織BMP-2、VEGF表達比較 與T0時間點比較，各組T1～T5時間點骨痂組織BMP-2、VEGF表達均升高(P均<0.05)。聯合組BMP-2、VEGF表達均高于其余各組，ESW組均高于仙桃草組、對照組(P均<0.05)。仙桃草組T1～T5時間點骨痂組織VEGF表達均高于對照組(P均<0.05)，骨痂組織BMP-2表達比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組骨痂組織BMP-2、VEGF表達比較

注：與同組T0時間點比較，*P<0.05；與聯合組同時間點比較，△P<0.05；與桃仙草組同時間點比較，#P<0.05；與ESW組同時間點比較，▲P<0.05。

3 討論

研究證實，ESW可以誘導血管生成，上調成骨相關生長因子，從而促進細胞的增殖和分化，有助于組織再生[3～5]。仙桃草具有化瘀止血、清熱消腫、止痛等功效，主治跌打損傷[6～7]。現代藥理研究表明，仙桃草的主要化學成分為β-谷甾醇、胡蘿卜苷、綠原酸等[8]。綠原酸是仙桃草的成骨活性成分之一，能夠促進成骨細胞增殖分化[9]。本研究結果表明，隨時間延長，聯合組和ESW組骨痂逐漸增多，骨痂密度升高，骨不連處逐漸愈合；聯合組T2～T5時間點骨折愈合情況均優于ESW組；仙桃草組和對照組骨折間隙仍存在，骨折端仍為硬化骨，各時間點骨折愈合情況無明顯變化。說明ESW聯合仙桃草可促進兔橈骨骨不連的愈合。

骨組織的愈合受多種細胞生長因子的調控。BMP-2和VEGF的成骨作用比較突出[10，11]。BMP-2是促進骨愈合的重要生物因子[12]，其表達上調能增強組織細胞向成骨細胞分化的潛能，促進成骨；其表達下降則可導致間質細胞向成纖維細胞轉化，抑制成骨。Shibasaki等[13]研究認為，BMP-2主要是通過阻斷c-Met通路實現其成骨作用。VEGF為一種有效的血管生成因子，能夠促進骨痂內毛細血管生成，新生毛細血管長入后可帶來大量骨生長所需的細胞因子和生長因子，從而促進骨不連的愈合[14]。本研究各組T0時間點骨痂組織BMP-2、VEGF表達比較差異無統計學意義，可能與觀察時間短有關；仙桃草組T1～T5時間點骨痂組織VEGF表達均高于對照組，而兩組骨痂組織BMP-2表達比較差異無統計學意義，說明仙桃草的主要作用在于上調VEGF表達，加速骨不連斷端毛細血管生成，為骨痂生長帶來必須的營養成分，間接促進骨不連愈合[15～17]。聯合組T1～T5時間點骨痂組織BMP-2、VEGF表達均高于其余各組，ESW組均高于仙桃草組、對照組，說明ESW聯合仙桃草口服促進兔橈骨骨不連愈合的作用機制可能與其上調骨痂組織BMP-2、VEGF表達有關。分析原因，可能是沖擊波產生的微震動使本來硬化的骨端產生微小新鮮骨折，隨之發生無菌性炎癥，炎性反應導致機體釋放大量炎性物質，從而刺激局部BMP-2和VEGF表達上調[6,7]。BMP-2上調能夠促進骨痂生長，逐漸縮小骨斷端間隙，促進骨不連愈合； VEGF表達上調能激發骨斷端發生血管反應，使得大量新生毛細血管長入，帶來大量的營養物質及生長因子；二者相互協作，最終達到促進骨折愈合的目的。

綜上所述，ESW聯合仙桃草口服對兔橈骨骨不連的愈合具有促進作用，其機制可能與上調骨痂組織BMP-2、VEGF表達有關。但其具體作用機制及作用靶點尚不明了，且BMP-2和VEGF的表達是否存在相互作用也需要進一步探討。

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廣西醫療衛生重點科研課題(桂衛重2011120)；廣西中醫藥管理局中醫藥科技專項面上課題(GZPT1242)；廣西適宜衛生技術研發推廣人才小高地項目(006011)。

李宏宇(E-mail: lihongyu36@sohu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.36.009

R683

A

1002-266X(2016)36-0031-03

2015-12-10)