臍帶間充質干細胞移植治療肌萎縮側索硬化癥的短期療效及安全性分析

喬利軍，盧愛麗，馮梅，高紅霞，招遠祺

(廣東省中醫院，廣州 510006)

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論著·

臍帶間充質干細胞移植治療肌萎縮側索硬化癥的短期療效及安全性分析

喬利軍，盧愛麗，馮梅，高紅霞，招遠祺

(廣東省中醫院，廣州 510006)

目的 探討臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)移植治療肌萎縮側索硬化癥(ALS)的效果及安全性。方法 29例ALS患者接受4次UC-MSCs移植治療(蛛網膜下腔注射，2×107～5×107個細胞/次)。比較治療前后肌萎縮側索硬化功能評分量表(ALSFRS-R)評分、改良醫學研究委員會(MRC)評分，對安全性指標進行評價。治療后6個月以呼吸衰竭、死亡等為終點事件進行隨訪。結果 ALSFRS-R評分：治療前后總分比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后第14天穿衣和衛生評分明顯高于治療前(P=0.036)；治療后第28天，言語、穿衣和衛生功能評分明顯高于治療前(P分別為0.032、0.015)，且言語功能評分明顯高于治療后第14天(P=0.040)。MRC評分：治療后第14天上肢肌群肌力評分明顯高于治療前(P=0.050)，治療第28天上肢肌群肌力評分進一步增加(P=0.036)。隨訪至治療后6個月，1例患者于治療后第3個月因呼吸衰竭死亡，其余患者無嚴重不良事件。結論 UC-MSCs移植治療ALS短期效果好且較為安全。

臍帶間充質干細胞；肌萎縮側索硬化癥；ALSFRS-R評分；MRC評分；安全性

肌萎縮側索硬化(ALS)是人類運動系統的一種特發性嚴重的神經變性病，其選擇性累及脊髓前角細胞、腦干運動神經核以及錐體束，是成人運動神經元病的最常見類型[1]。近年來對ALS的發病機制雖已有初步認識。但自1996年美國FDA批準利魯唑用于ALS的治療以來，目前尚無新的有效治療方法[2]。臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)具有修復受損組織[3]、利于造血重建[4]和調節免疫功能[5]的功效，其向神經細胞分化的能力為ALS的治療帶來新的希望[6]。本研究探討UC-MSCs移植治療ALS的短期療效及安全性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年4月～2012年12月我院收治的29例ALS患者，男24例、女5例，就診年齡38～73(55.86±9.35)歲，病程0.5～11(2.76±2.29)年。均符合中國ALS診斷和治療指南[1]及世界神經病學聯盟1994年EI Escorial會議上制定的ALS臨床診斷標準[7]。納入標準：①符合ALS診斷標準；②一般狀況可，生命體征平穩；③本人或家屬、委托人自愿接受干細胞治療，并已經簽署干細胞治療知情同意書。排除標準：①休克、全身衰竭等危重情況及不能配合檢查者；②晚期惡性腫瘤者；③存在全身嚴重感染疾患者；④合并嚴重臟器功能障礙者；⑤凝血功能障礙者；⑥血清病原學檢查陽性者，如HIV抗體陽性，梅毒抗體RPR陽性；⑦嚴重精神障礙者。本研究通過廣東省中醫藥局審批，具有干細胞治療資質，本治療方案經我院醫學倫理委員會批準(倫理號：B2016-061-01)。

1.2 UC-MSCs分離與培養 UC-MSCs由深圳市北科細胞工程研究所提供。取足月順產、無并發癥的新生兒臍帶，生理鹽水沖洗，切割至乳糜狀，接種于75 cm培養瓶中，每瓶含20 mL低糖細胞培養基(DMEM)完全培養液(含10%胎牛血清)，置37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱培養。24～48 h后換液，去掉非貼壁細胞，之后每3天以低糖DMEM完全培養液換液1次。培養至貼壁細胞90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代，擴增后的間充質干細胞(MSCs)計數并鑒定。檢測艾滋病病毒抗體、梅毒抗體、肝炎標志物5項、TORCH 5項，檢測合格后制備成UC-MSCs懸液，每份細胞數量為2×107～5×107個。

1.3 UC-MSCs移植 患者取側臥位，成人取L3～L4椎間隙為穿刺點，局部麻醉后進針，在無菌操作下將UC-MSCs緩慢注入蛛網膜下腔，術后去枕平臥6 h，每個療程進行4次移植治療。具體方法參照《干細胞應用新技術》[8]。

1.4 相關指標觀察 ①臨床效果：治療前及治療后行修訂的肌萎縮側索硬化功能量表(ALSFRS-R)評分(總分48分；0分為嚴重受損，48分為正常)[9]、改良的醫學研究委員會肌力評定量表(MRC)評分(滿分為12分，評分越高說明肌力越好)[10]。②安全性觀察：觀察治療過程中不良反應(發熱、頭痛、過敏)發生情況。觀察實驗室指標(血常規、肝腎功能、艾滋病病毒抗體、梅毒抗體、肝炎標志物、腫瘤標志物)及心電圖變化。③隨訪：治療后6個月以呼吸衰竭、死亡等為終點事件進行隨訪。

2 結果

本組29例ALS患者均完成治療，進入結果分析，中途無脫落，其中1例血常規數據、3例肝功能數據、1例腎功能數據、4例腫瘤標志物數據缺失。

2.1 臨床效果

2.1.1 ALSFRS-R評分 移植治療后第14天，穿衣和衛生能力評分高于治療前(P=0.036)，總分及其余功能區評分均無明顯變化(P均>0.05)。治療后第28天，言語、穿衣和衛生能力評分明顯高于治療前(P分別為0.032、0.015)，言語功能評分明顯高于治療后第14天(P=0.040)，總分及其余功能區評分與治療前及治療后第14天比較均無統計學差異(P均>0.05)。詳見表1。

表1 29例ALS患者UC-MSCs移植治療前后ALSFRS-R評分比較

注：與治療前比較，△P<0.05；與治療后第14天比較，*P<0.05。

2.1.2 MRC評分 UC-MSCs移植治療后第14天，上肢肌群肌力評分明顯高于治療前(P=0.050)，治療第28天，上肢肌群肌力評分比治療前進一步升高(P=0.036)；頸部及下肢肌群肌力評分高于治療前，但無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 29例ALS患者UC-MSCs移植治療前后MRC評分比較

注：與治療前比較，△P≤0.05。

2.2 安全性觀察 本組2例出現自限性發熱反應(體溫<38.0 ℃)，未經處理，分別持續6、8 h自行降至正常。1例出現頭暈，腰穿腦脊液壓力為70 mmH2O，經補液支持治療后癥狀消失。4例出現局部疼痛，考慮與腰椎穿刺術操作有關，經對癥治療后疼痛均緩解。7例患者白細胞計數、13例患者甲胎蛋白(AFP)高于治療前(P均<0.01)，排除感染性及腫瘤性疾病，未處理，3個月后均降至正常范圍。29例患者肝腎功能、艾滋病病毒抗體、梅毒抗體、肝炎標志物、心電圖等指標治療前后比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

2.3 終點事件隨訪 隨訪6個月，1例于治療后3個月死于呼吸衰竭，其余28例無嚴重不良事件發生。

3 討論

ALS是由皮質、腦干及脊髓上下運動神經元受侵導致的一種漸進性神經退行性疾病，人群患病率高達7.4/100 000[11]。無論最初累及上或下運動神經元，最終均表現為肢體和延髓上、下運動神經元損害并存。過去的20年間超過50種藥物被用于ALS的治療，但只有利魯唑被證實對ALS具有一定的治療作用[12]。ALS呈進行性和致殘性病程，患者最終多死于呼吸肌麻痹或并發的呼吸道感染，生存期限從數月到10余年，平均3～5年[1,11,13]。本研究納入的29例ALS患者，病程(2.76±2.29)年，最長為11年。鑒于ALS的進展性和致命性，尋找新的有效療法尤為重要，應用干細胞移植來阻止或延緩ALS的進展逐漸成為臨床研究熱點。臍帶已成為除骨髓以外的重要干細胞來源，具有來源充足、免疫原性更弱、供者無痛苦、不涉及倫理問題、傳播疾病的概率低、含有的干細胞豐富等優點[14]。

目前，已有學者報道采用干細胞治療ALS[10,15～23]。部分研究結果顯示，干細胞移植治療后ALS患者的FVC、ALSFRS、Norris及MRC評分維持在穩定水平[10,15]；另有研究結果顯示，干細胞移植治療可明顯改善ALS患者的FVC、ALSFRS和Norris評分[17～19,21～23]。因而干細胞移植治療ALS的療效仍不確切。本研究以UC-MSCs作為干細胞主要來源，治療前后ALSFRS-R總分比較差異無統計學意義，但治療后ALS患者的言語、穿衣和衛生能力評分明顯高于治療前，說明VC-MSCs移植改善功能方面近期療效明顯。改良MRC評分反可反映ALS患者肌群的肌力情況及神經功能受損程度，對各功能區MRC評分的前后比較顯示，治療后第14天，上肢肌群肌力較治療前顯著改善；治療第28天，上肢肌群肌力有進一步改善。通過治療前后ALSFRS-R、MRC評分的比較，表明UC-MSCs移植對ALS患者的言語、肢體運動功能、生活能力有一定的改善作用。

UC-MSCs移植常見的不良反應包括輕度的發熱、頭暈、腰痛、臀部疼痛、肢痛等，分析原因可能與移植后輕度的免疫排斥反應、低顱壓綜合征、穿刺部位脊膜刺激征或穿刺點韌帶損傷有關，這些不良反應癥狀輕微，經對癥治療多在3天內消失。

本研究7例患者白細胞計數治療后第28天明顯高于治療前，但無發熱及感染，后均降至正常范圍；白細胞升高可能系干細胞移植后輕度的免疫反應引起。有研究者發現，干細胞移植過程中靜推地塞米松防止變態反應也可導致一過性的白細胞計數升高[22]。AFP是在胚胎時期由胎兒肝細胞及卵黃囊產生的一種特異性球蛋白，在成人血清中含量極低，是肝癌的特異性標志。本研究所有患者治療前已排除腫瘤病史，治療后第28天AFP明顯高于治療前。其升高的原因可能是本研究所用干細胞來源于臍血，而臍血中可能含有較高的AFP[24,25]。CEA為臨床常用的一個廣譜腫瘤標志物，在胃癌、直腸癌、胰腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳腺癌和肺癌等病程監測中有重要意義，本組患者治療前后CEA改變無統計學差異。本研究腫瘤標志物檢測結果提示，UC-MSCs移植治療ALS短期內無明顯致瘤性。其余安全性指標、如肝腎功能、艾滋病病毒抗體、梅毒抗體、肝炎標志物、心電圖等，治療前后比較差異無統計學意義，提示UC-MSCs移植治療ALS在短期內安全性良好。

本研究隨訪結果顯示，未發現任何嚴重的免疫排斥反應或者腫瘤。少數患者病情持續進展，大部分患者病情維持在治療后水平。提示ALS病機復雜，UC-MSCs移植治療ALS在短期內可明顯改善患者的神經功能癥狀，但是長期療效還有待進一步證實。

綜上所述，UC-MSCs移植治療ALS短期內安全有效，能顯著改善患者的言語、肢體運動功能等生活能力，增強上肢肌群肌力，提高患者的生活質量，延緩病情發展，但不能逆轉疾病進展。本研究存在周期較短、樣本量較少、未設置病例對照研究等方面的不足，關于UC-MSCs移植治療ALS的遠期療效及遠期安全性還有待進一步探討。

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Short-term efficacy and safety of transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells in treatment of amyotrophic lateral sclerosis

QIAOLijun,LUAili,FENGMei,GAOHongxia,ZHAOYuanqi

(GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Objective To evaluate the short-term clinical efficacy and safety of transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) in treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Methods Twenty-nine patients with ALS were treated with UC-MSCs transplantation for 4 times (lumbar puncture, 2×107to 5×107cells/time). Revised Amyotrophic Lateral Sclerosis Functional Rating Scale (ALSFRS-R) and Medical Research Council (MRC) scale for assessment of muscle power were assessed before and after the transplant. Safety indexes were evaluated at the same time. Results No significant difference of ALSFRS-R scale was observed (P>0.05). There was a significant improvement in the dressing and health abilities in ALS patients on the 14th day after treatment (P=0.036), and the scores of verbal, dressing and health abilities on the 28th day after treatment were significantly higher than those before treatment (P=0.032, 0.015). In addition, the speech function was further improved compared with that on the 14th day after treatment (P=0.040). The strength of upper limb muscles was enhanced with the extension of treatment (P=0.050, 0.036, on the 14th and 28th day after treatment ). Followed up for 6 months after treatment, only 1 patient died of respiratory failure at the 3th month, and the remaining patients had no serious adverse events. Conclusions UC-MSCs transplantation is safe and effective for ALS in the short-term.

umbilical cord mesenchymal stem cells; amyotrophic lateral sclerosis; ALSFRS-R; MRC scale; safety

廣東省自然科學基金資助項目(2015A030310436)；廣東省中醫藥管理局科研資助項目(20151210)。

喬利軍(1984-)，男，博士后，研究方向為細胞治療中醫腦病的基礎與臨床研究。E-mail: qiaolijunwork@163.com

簡介：招遠祺(1978-)，男，博士、副主任醫師，研究方向為中醫腦病的臨床與基礎研究。E-mail: tcm2008@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.36.001

R744.8

A

1002-266X(2016)36-0001-04

2016-02-25)