HPLC測定不同產地防風中4種有效成分的含量

胡紫艷馮振斌蔣健

（1南京市食品藥品監督檢驗院，江蘇 南京210000；2吉林省藥品檢驗所，吉林 長春130033）

HPLC測定不同產地防風中4種有效成分的含量

胡紫艷1馮振斌2蔣健1

（1南京市食品藥品監督檢驗院，江蘇 南京210000；2吉林省藥品檢驗所，吉林 長春130033）

目的：建立防風中4種有效成分的含量測定方法，并比較不同產地防風4種成分的含量。 方法：色譜柱：Agilent HC C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；甲醇-水（45∶55）為流動相；檢測波長為254 nm；柱溫35℃。結果：升麻素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷4種色原酮類成分的加樣回收率均在95%～105%，其RSD均＜3%。結論：不同產地防風藥材4種有效成分的含量差別較大；所建立的同時測定升麻素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷4種有效成分的測定方法準確度、重復性好，專屬性強，可有效評價不同產地防風藥材的質量。

防風；產地；升麻素；升麻素苷；5-O-甲基維斯阿米醇苷；亥茅酚苷；高效液相色譜法

本品為傘形科植物防風〔Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.〕的干燥根。春、秋二季采挖未抽花莖植株的根，除去須根及泥沙，曬干[1]。防風按野生產區可分為口防風、關防風、西北防風；防風的栽培品為家防風，家防風是各地栽培品的統稱[2]。由于防風品種復雜，性狀鑒定困難，混淆品多，栽培用種不確切，導致藥材質量參差不齊[3]。目前文獻研究較多的是野生品和栽培品的質量差異[4-8]。歷代本草對防風產地的記載主要包括陜西、黑龍江、山東、河南、江蘇、浙江及湖北北部等地。現今，防風的主要產區為東北和內蒙古，質量也以東北的黑龍江為最佳。古今防風的產區變化很大，主要是防風的產地由南向北移，由關內移到了關外的東北和內蒙古地區[9]。肖永慶等[10]對不同產地的防風藥材及飲片分析，發現不同產地的樣品品質有很大差別。藥理實驗研究表明，防風具有解熱、鎮痛、鎮靜、抗炎、抗過敏、抗驚厥、抑菌和增強機體非特異性免疫功能的作用[11-13]。前人研究表明，防風中所含有的色原酮類成分，是其發揮藥效作用的主要物質基礎，其中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥矛酚苷四種色原酮類均有降壓作用。升麻素和亥矛酚苷還有消炎、止痛作用[14-17]。本文對河北、吉林、遼寧、內蒙古、甘肅、山西、黑龍江、山東等不同產地的樣品進行了 4種有效成分升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量的同時測定，并比較各產地的含量差異，為防風藥材的質量評價提供了科學依據。現報道如下。

1　儀器與試藥

LC-2010CHT高效液相色譜儀；試劑：甲醇為色譜純，水為超純水；升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥矛酚苷對照品（批號：111522-200406，111523-200405，111710-200501，111714-200501，購自中國食品藥品檢定研究院）。

防風藥材 10批（產地分別為：河北、吉林、遼寧、內蒙古、甘肅、山西、黑龍江、山東），均為2年生秋季采挖植株。10批次供試品經南京市食品藥品監督檢驗院藥品所鑒定，均為防風的干燥根。

2　方法與結果

2.1色譜條件

固定相：Agilent HC C18色譜柱 （250 mm× 4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇 ∶水（45∶55）；流速：1.0 m L/min；柱溫：35℃；檢測波長為 254 nm；理論板數按升麻素苷峰計算應不低于4 000。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液取升麻素苷對照品、升麻素對照品、亥茅酚苷對照品和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 m L含49，71，89，90μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液取本品細粉約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 m L，稱定質量，水浴回流 2小時，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3干擾試驗

分別吸取對照品溶液、供試品溶液及溶劑各5μL，按上述色譜條件進行測定，色譜圖見圖1～ 3。結果表明其他成分測定無干擾。

圖1　溶劑HPLC圖

圖2　對照品HPLC圖

圖3　供試品HPLC圖

2.4標準曲線的繪制與線性關系考察

精密量取升麻素苷對照品溶液（0.490 mg/m L）1，2，5，10，20m L，升麻素對照品貯備液（0.712mg/m L）0.5，1，2，5，10 m L，亥茅酚苷對照品貯備液（0.893 mg/m L）0.5，1，2，5，10 m L，5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品貯備液（0.901 g/m L）0.5，1，2，5，10 m L，分別置于50 m L容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取5μL注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件測定升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積。以濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得升麻素苷回歸方程：

Y＝ 6.332 7X－3.163 2，

r＝ 0.999 9（n＝ 5），線性范圍為9.80～196.00μg/L；

升麻素回歸方程：

Y＝ 20.556X－ 0.752 3，

r＝ 1（n＝ 5），線性范圍為7.12～142.40 μg/L；

亥茅酚苷回歸方程：

Y＝8.132 4X－6.607，

r＝ 0.999 7（n＝ 5）線性范圍為8.93～178.60μg/L；

5-O-甲基維斯阿米醇苷回歸方程：

Y＝4.847 8X－1.999 4，

r＝ 0.999 9（n＝ 5），線性范圍為9.05～181.00μg/L。

2.5精密度試驗

取同一供試品溶液 （產地遼寧），連續進樣6次，結果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷峰面積的 RSD分別為 0.35%，0.45%，0.63%和0.92%，表明儀器精密度良好。

2.6穩定性試驗

取同一供試品溶液（產地遼寧）5μL，分別在0，4，8，16，24 h，重復進樣共 6次，測定峰面積。結果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷峰面積的RSD分別為0.60%，0.71%，0.97%和1.02%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7重現性試驗

取同一供試品（產地遼寧）6份，依法獨立測定。結果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷的平均含量分別為0.257%，0.151%，0.379%，0.045%，RSD分別為1.03%，0.80%，0.59%和0.66%，表明本法的重現性良好。

2.8回收率試驗

精密稱取已知含量（升麻素苷含量為2.602mg/g、升麻素為1.541 mg/g、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量為3.818 mg/g和亥茅酚苷含量為0.463 mg/g）的樣品（產地遼寧）0.25 g，分別精密加入低、中、高3個加入量的混合對照品溶液 （每個加入量 3份），按“2.2.2”項下方法制備，照“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1　加樣回收率試驗結果

3　樣品測定結果

取對照品溶液、供試品溶液適量，按上述色譜分析條件測定，測定10批樣品，結果見表2。

4　討論

4.1測定波長的選擇

取本品細粉約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 m L，稱定質量，水浴回流2小時，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。取供試品溶液2μL，注入液相色譜儀，分別在254，270，280，300，320 nm進行測定，結果254 nm各色譜峰信號最強，給出信息最多，故選擇254 nm作為測定波長。

4.2提取溶劑的選擇

本試驗考察了75%甲醇、乙醇和甲醇三種溶劑，結果特征峰差異不大，考慮到流動相為甲醇-水，故選擇甲醇作溶劑。

4.3流動相的選擇

參照《中國藥典》（2010年版）一部“防風”含量測定項下的方法，以甲醇 ∶水（40∶60）為流動相，亥矛酚苷色譜峰保留時間太長，故將流動相比例調整為甲醇 ∶水（45∶55），對照品色譜峰保留時間適當，供試品色譜峰分離效果好。經等梯度洗脫，采集時間為100分鐘，樣品在 40分鐘以后未出現其他特征峰。故采用甲醇 ∶水（45∶55）為本法的流動相。

表2　樣品測定結果

5　總結

防風作為藥用商品品種較多，來源復雜，近緣種作為習用品應用較多。本研究從生藥主產地隨機抽樣，結果不同產地的防風藥材及飲片中4種色原酮類成分含量差別很大，其中吉林、內蒙古東部、黑龍江、遼寧的藥材中 4種有效成分的總含量明顯高于其他產地；河北和甘肅均查出不合格樣品。與邵留英等[18]對不同產地防風飲片中有效成分含量比較一文的測定結果一致，并以升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷作為測定指標佐證了東北三省是防風的道地藥材[19]。這可能與各地氣候條件、土壤狀況、緯度、海拔、高度、日照強度、栽培條件、采集季節以及藥材的儲存條件等因素不同有關，已有研究表明不同生長環境防風凈光合速率、蒸騰速率及水分利用效率等均有變化[20]，具體原因還有待進一步探討。由于不同來源產地藥材4種色原酮含量存在差異，可為該藥材品種及產地的鑒別提供一個思路，為市場上不同來源產地藥材的使用提供一定的借鑒作用，同時也為防風中藥材市場藥材規范化管理、藥品質量保障、藥材鑒定等方面提供了參考依據。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：140.

[2]宋美錄，呂麗，李繼紅，等.藥用防風及其近緣種的顯微性狀調查[J].河北北方學院學報，2015，31（6）：96-99.

[3]李繼紅，李薊龍，范翠麗，等.藥用防風及其近緣種的性狀調查[J].河北中醫藥學報，2014，29（4）：38-41.

[4]馮學鋒，付桂芳，格小光，等.中藥防風栽培品與野生品藥材性狀顯微組織差異比較研究[J].中國中藥雜志，2009，34（22）：2862-2866.

[5]馬麗杰，楊濱，馮學鋒，等.野生與栽培防風中升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量測定及指紋圖譜分析[J].中國中藥雜志，2010，35（13）：1731-1734.

[6]陳梁，李麗，肖永慶，等.仿野生與人工栽培防風飲片的色彩色差分析[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（12）：92-94.

[7]李康，周新蓓.防風野生與栽培品的質量對比研究[J].中國現代藥物應用，2010，4（10）：118-119.

[8]單靜穎，劉娟.野生防風與栽培防風的鑒別及微量元素測定[J].黑龍江醫藥科學，2008，31（3）：36-37.

[9]王成章，張崇禧.防風國內外研究進展[J].人參研究，2008（1）：35-41.

[10]肖永慶，楊濱，姚三桃，等.防風質量標準的研究[J].中國中藥雜志，2001，26（3）：185-187.

[11]高鳳蘭，孫雪云，哈永年.野生和種植防風的成分測定[J].黑龍江中醫藥，1990（3）：46-47.

[12]森立輯.神農本草經[M].上海：群聯出版社，1955：59.

[13]王建華，樓之岑.中藥防風的研究概述[J].中國藥學雜志，1992，（27）：323.

[14]王林麗，宋志勇.防風的研究進展[J].中國藥業，2006，15（10）：63-64.

[15]高鴻霞，邵世和，王國慶.中藥防風的研究進展[J].井岡山醫專學報，2004，11（4）：12-14.

[16]薛寶云，李文，李麗，等.防風色原酮甙類成分的藥理活性研究[J].中國中藥雜志，2000，25（5）：297-299.

[17]竇紅霞，高玉蘭.防風的化學成分和藥理作用研究進展[J].中醫藥信息，2009，26（2）：15-17.

[18]邵留英，喻志斌，瞿發林.不同產地防風飲片中有效成分含量比較[J].海峽藥學，2013，25（2）：52-54.

[19]王少一.防風的正品偽品鑒別[J].黑龍江醫藥，1996，9（6）：313.

[20]韓忠明，王云賀，林紅梅，等.吉林不同生境防風夏季光合特性[J].生態學報，2014，34（17）：4874-4881.

Determ ination of Four Components in Saposhnikovia Divaricata from Different Habitats by HPLC

Hu Ziyan1，Feng Zhenbin2，Jiang Jian1（1 Nanjing Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Nanjing 210000，China；2 Jilin Institute for Drug Control，Jilin Changchun 130033）

Objective：To develop a HPLC method for simultaneous determ ination of 4 bioactive components in saposhnikovia divaricata，and to compare the content of the 4 components in S.divaricata from different habitats. M ethods：Agilent HC C18column(250 mm×4.6 mm，5μm)wad adopted，using the m ixture of methanol and water（45∶55）as amobile.Thewavelength for detection was setat254 nm，while the temperature of column at35℃. Results：The recovery rates of cimicifugin，Prim-o-glucosylcimifugin，4’-O-beta-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol and sec-O-glucosylhamaudol were 95% ～ 105%，w ith RSDs of less than 3%.Conclusion：The contents of four bioactive components in S.divaricata from variou habitats showed significant difference.However，the developed HPLC method for simultaneous determ ination of the four components showed high accuracy，reproducibility and specificity，which was effective in evaluation of quality of S.divaricata.

Saposhnikovia Divaricata； Habitats； Cimifugin； Prim-O-glucosylcimifugin； 4’-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamm inol；Sec-O-glucosylhamaudol；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.11.007

胡紫艷，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：huzy0903@163.com

（2016-06-29）