大蒜皮降解芽孢桿菌屬細菌J-5發酵條件優化

梁寶東，魏海香，姜淑喆，楊永濤

（1.濟寧學院生命科學與工程系，山東 曲阜 273155；2.山東大學生命科學學院，山東 濟南 250013）

大蒜皮降解芽孢桿菌屬細菌J-5發酵條件優化

梁寶東1，魏海香1，姜淑喆2，楊永濤1

（1.濟寧學院生命科學與工程系，山東 曲阜 273155；2.山東大學生命科學學院，山東 濟南 250013）

利用響應面法對芽孢桿菌屬細菌J-5菌株產羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）的發酵條件進行優化。通過單因素試驗，研究了氮源、碳氮比、初始pH值、料水比、發酵溫度、發酵時間、輔助碳源等對產CMCase酶活性的影響，再此基礎上選擇料水比、碳氮比、初始pH值三因素進行響應面設計，考察各因素對CMCase酶活性的影響及相互作用。確定最佳產酶條件為碳氮比25∶1（m/m）、初始pH 3.2、料水比

大蒜皮；羧甲基纖維素酶；響應面分析

在自然界中，纖維素是最廣泛存在的可再生資源[1]。在大蒜加工過程中，其秸稈及大蒜皮只有少數作為牛、羊的食料，多數作為廢棄物隨意丟棄。大蒜秸稈、蒜皮等廢棄物含有豐富的有機物質，經檢測大蒜的普通干秸稈中（以總質量計）各組分含量為粗纖維24.63%、粗蛋白8.68%、粗脂肪0.96%、粗灰分14.51%、水分12.62%、鈣2.29%、磷0.25%、無氮浸出物38.59%、總糖沒有檢出[2]。但是，大蒜秸稈及皮中含有的抗菌物質，如大蒜素等，不利于微生物的生長，是限制其被利用的關鍵[3]?，F在利用秸稈的方法主要有一些物理、化學和生物的方法，其都存在不能充分利用、處理成本高等問題，只有生物降解法是利用秸稈的最佳途徑[4]。眾多國內外專家學者一直致力于尋找并改造能高效降解纖維素的菌種。因此，產纖維素酶菌種的分離、篩選及優化其產酶條件一直是相關研究領域的熱點之一[5-7]。據報道，里氏木霉（Trichlderma ressiei）、綠色木霉（Trichoderma viride）、康氏木霉（Trichoderma koniggii）等微生物具有較高的纖維素降解能力[8-11]。但受制于這些菌株較高的產酶條件，同時由于秸稈中天然纖維素結構的復雜性、高惰性，處理大蒜廢棄物時依然存在轉化率低、時間長、成本偏高等諸多問題，難以利用纖維素酶進行大規模生產[12-13]。研究菌種產酶條件是提高纖維素酶活性、增加產酶量的重要途徑之一[14-15]。本實驗擬研究大蒜皮降解菌株的產酶條件，以期將大蒜皮高效降解為糖和蛋白質，為蒜皮降解提供理論依據及技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

J-5菌株（野生）篩選自大蒜皮自然降解物，革蘭氏陽性，桿狀，有芽孢，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus Cohn），濟寧學院生命科學實驗中心保存。

液體發酵產酶培養基：蛋白胨3 g、硫酸銨2 g、酵母膏0.5 g、KH2PO44 g、CaCl20.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、吐溫-80 0.2 g、羧甲基纖維素鈉10 g、蒸餾水1 000 mL，初始pH 5.0。

固體發酵產酶培養基：粉碎的無霉變大蒜皮粉（取自加工廠的新鮮大蒜皮，烘干后粉碎10目）20.0 g、(NH4)2SO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、K2HPO40.1 g、蒸餾水70 mL，初始pH 5.0，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min。

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉 北京澳博星生物技術有限責任公司；羧甲基纖維素鈉、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4、檸檬酸、檸檬酸三鈉（均為分析純） 天津市英博生化試劑有限公司；剛果紅 天津市津北精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；XB120A電子天平 上海精密科學儀器有限公司；HZQ-X160恒溫振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠；723PC可見光分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；TD6離心機 常州市華普達教學儀器有限公司；YXQ-SL-50SLL立式壓力滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；雷磁PHS-3C型pH計 南京互川電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固體發酵產酶的單因素試驗

1.3.1.1 氮源對羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）產量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液，加入到以2 g/100 g蛋白胨、1 g/100 g蛋白胨加1 g/100 g硫酸銨、2 g/100 g硫酸銨分別作為氮源的不同固體產酶培養基中，其他成分不變，每組3 個平行，料水比1∶4（m/V）、35 ℃培養5 d，測其酶活力。

1.3.1.2 料水比對CMCase產量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到料水比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（m/V）的不同固體產酶培養基中，振動混合均勻，每組3 個平行，35 ℃培養5 d，測其酶活力。

1.3.1.3 碳氮比對CMCase產量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到碳氮比為5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1（m/m）的不同固體產酶培養基中。每組3 個平行，料水比1∶4（m/V），35 ℃培養5 d，測其酶活力。

1.3.1.4 初始pH值對CMCase產量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到初始pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的不同固體產酶培養基中，每組3 個平行，料水比1∶4（m/V）、35 ℃培養5 d，測其酶活力。

1.3.1.5 發酵溫度對CMCase產量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到15 個相同條件的固體產酶培養基中，每組3 個平行，料水比1∶4（m/V），分別于29、32、35、38、41 ℃條件下培養5 d，測其酶活力。

1.3.1.6 發酵時間對CMCase產量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到15 個相同條件的固體產酶培養基中，每組3 個平行，料水比1∶4（m/V）、35 ℃分別培養72、96、120、144、168 h，測其酶活力。

1.3.1.7 輔助碳源（葡萄糖）對CMCase產量的影響

自我教育是指個體根據需求，有目的、有計劃地對自我提出要求，把自我作為認識、驅動、調控與改造的對象，為提高和完善自我而進行的一種教育活動。自我認識、自我驅動、自我踐行、自我調控、自我實現是自我教育的五要素，這些要素之間是相互聯系、互為作用的動態合作關系。自我教育作為一種自主學習的教育方式，具有其他教育形式不可替代的作用——讓受教育者從學習客體轉變為學習主體。在提倡終身教育的時代背景下，自我教育是現代人儲備知識、提升能力不可或缺的一種教育與學習方式。

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到葡萄糖含量為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/100 g的不同固體產酶培養基中。每組3 個平行，料水比1∶4（m/V）、35 ℃培養6 d，測其酶活力。

1.3.2 固體發酵產酶條件的響應面優化

根據Box-Behnken中心設計原理[16]，結合單因素試驗結果，以料水比、碳氮比、初始pH值3 個關鍵因素作為自變量[17-18]，以-1、0、+1分別代表自變量的低、中、高水平，以CMCase酶活力為響應值設計三因素三水平試驗，各因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平編碼Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

1.3.3 驗證實驗

用響應面試驗結果的最優化組合，降解大蒜皮，測定其CMCase酶活力。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 葡萄糖標準曲線

參照文獻[19]方法。取9 支洗凈烘干的25 mL具塞刻度試管，分別加入1.0 mg/mL的標準葡萄糖溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，再分別向各試管中加入蒸餾水至溶液總體積為2.0 mL，配制成一系列不同質量濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液，搖勻后沸水浴5 min。取出立即流水冷卻后用蒸餾水定容至25 mL，充分混勻。用723分光光度計在波長520 nm處，以1號試管溶液作為空白對照，調零點，測定其他各管溶液的光密度值并記錄結果。以葡萄糖質量為橫坐標，以對應的光密度值為縱坐標，繪制曲線即為葡萄糖的標準曲線。得光密度值（y）與葡萄糖質量（x）的線性關系為：y＝0.618 6x-0.000 8。

參照文獻[21-22]方法。取4 支洗凈烘干的25 mL具塞刻度試管，編號后各加入1.0 mL酶液和1.5 mL pH 4.4、5 g/L羧甲基纖維素鈉的檸檬酸緩沖液，1號試管加入1.5 mL的DNS溶液鈍化酶活性，作為參比溶液。50 ℃水浴保溫30 min。取出后立即向2、3、4號試管各加入1.5 mL DNS溶液終止酶反應，充分搖勻，沸水浴5 min，取出立即流水冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻，參比溶液調零，波長520 nm處測2、3、4號試管的光密度值，求平均值，通過標準曲線查出對應的葡萄糖含量，酶活力計算見下式：

式中：m1為葡萄糖質量/mg；V1為酶液定容體積/mL；V2為反應液中酶液的加入量/mL；m2為樣品質量/g；t為時間/h；5.56為l mg葡萄糖微摩爾數（1 000/180＝5.56）。

1.3.4.3 殘余還原糖含量的測定

取4 支洗凈烘干的25 mL具塞刻度試管，編號后向2、3、4號試管中各加入1.0 mL酶液和1.5 mL DNS溶液，1號中只加DNS作為參比溶液，充分搖勻沸水浴5 min，取出立即流水冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻，參比溶液調零，波長520 nm處測2、3、4號試管的光密度值，求平均值，通過標準曲線查出對應的葡萄糖含量[23]。

2 結果與分析

2.1 產酶條件單因素試驗結果

2.1.1 氮源對CMCase產量的影響

圖1 氮源種類對CMCase產量的影響Fig. 1 Effect of nitrogen source on CMCase production

由圖1可知，在上述3 個組合中，蛋白胨為唯一氮源時，產CMCase量最少，CMCase酶活力只有21.145 U/g；蛋白胨和硫酸銨同時做氮源時，CMCase酶活力略有提高；無機氮源硫酸銨為唯一氮源時，CMCase酶活力最高為30.309 U/g。結果表明，菌株J-5受氮源影響不大，均能有效的利用，且無機氮源更有利于CMCase酶的合成。硫酸銨價格低，更適合工業化生產，因此選用硫酸銨為唯一氮源。

2.1.2 料水比對CMCase產量的影響

圖2 料水比對CMCase產量的影響Fig. 2 Effect of solid-to-liquid ratio on CMCase production

由圖2可知，隨著水含量的增大CMCase酶活力逐漸提高，在料水比為1∶4（m/V）時，達到最大值。當料水比超過1∶4（m/V）時CMCase酶活力出現下降趨勢，由34.080 U/g下降到19.157 U/g。這是因為水是微生物生長的必要條件之一，大蒜皮吸水膨脹軟化，有利于降解纖維素菌株J-5的生長和代謝。但當水含量過大時導致一些營養物質（某些纖維素和無機離子）的濃度下降，從而使CMCase酶活力產生下降趨勢。因此在固體發酵培養中，確定一個最佳的料水比對產酶尤為重要。

2.1.3 碳氮比對CMCase產量的影響

圖3 碳氮比對CMCase產量的影響Fig. 3 Effect of carbon/nitrogen ratio on CMCase production

由圖3可知，隨著碳氮比的逐漸增大CMCase酶活力逐漸提高，在碳氮比約為20∶1（m/m）時達到最大值，當碳氮比大于20∶1（m/m）時，其CMCase酶活力開始降低，由20∶1（m/m）時的33.367 U/g降為40∶1（m/m）時的18.245 U/g。這是由于碳氮比直接影響菌株生長和代謝，一般降解纖維素的菌株對氮源的需求量有一個很低的最佳值。

2.1.4 初始pH值對CMCase產量的影響

圖4 初始pH值對CMCase產量的影響Fig. 4 Effect of initial medium pH on CMCase production

由圖4可知，隨著初始pH值的增大CMCase酶活力逐漸提高。CMCase酶活力在初始pH值為4.0時達到最大值，在pH 3.0～4.0時變化較顯著，由30.032 U/g增加到37.099 U/g。當初始pH值大于4.0時CMCase酶活力降低比較明顯，其后隨pH值增大一直緩慢的降低。說明了CMCase酶為一種酸性酶，偏向于較酸的環境，更有利于該菌株CMCase酶的生產代謝和積累，最適發酵pH值為4.0。

2.1.5 發酵溫度對CMCase產量的影響

圖5 發酵溫度對CMCase產量的影響Fig. 5 Effect of fermentation temperature on CMCase production

由圖5可知，隨著發酵溫度的升高CMCase酶活力逐漸提高。CMCase酶活力在發酵溫度為38 ℃時達到最大值，約33.25 U/g。當發酵溫度為41 ℃時，CMCase酶活力較38 ℃時的顯著降低，降至18.35 U/g。每個菌種都有最適產酶的發酵溫度，在此溫度條件下該菌株能更好地進行胞外酶的生產和積累。該菌種最適宜發酵溫度為38 ℃，明顯高于常見產CMCase霉菌適宜的發酵溫度。

2.1.6 發酵時間對CMCase產量的影響

圖6 發酵時間對CMCase產量的影響Fig. 6 Effect of fermentation duration on CMCase production

由圖6可以看出，在144 h以前，隨著發酵時間的延長CMCase酶活力逐漸提高。在72 h，CMCase酶活力處于較低的水平，合成和代謝比較緩慢。發酵至72～96 h，CMCase酶活力變化較為明顯，由12.759 U/g增長到20.192 U/g。發酵時間至120 h時，CMCase酶活力為32.27 U/g，酶的合成處于加速時期。在144 h時，酶活力達到最大值，約37.818 U/g。當發酵時間大于144 h時CMCase酶活力開始降低。因此控制發酵時間尤為重要，這是因為每個菌種都有生長周期，要先測定好菌株的生長周期才能更好地找到CMCase積累最多的時間。

2.1.7 葡萄糖含量對CMCase產量的影響

由圖7可知，在加入少量輔助碳源時，CMCase酶活力比大蒜皮做唯一碳源時低，如在含有0.5 g/100 g的葡萄糖時，CMCase酶活力比不加時低。在輔助碳源質量分數到達1 g/100 g時，CMCase酶活力最高達到31.706 U/g。當輔助碳源超過1 g/100 g時CMCase酶活力出現下降趨勢。這由葡萄糖效應引起，即初始的少量葡萄糖被菌體生長利用，一段時間后，菌體分泌CMCase，此酶分解纖維素生成葡萄糖，從而導致培養基內積累的葡萄糖抑制菌株J-5對CMCase的分泌。也就是說葡萄糖等速效碳源能引起CMCase的阻遏效應。因此應控制葡萄糖的加入量，使加入的葡萄糖剛好被利用促進前期菌種的生長，而又不影響CMCase的合成。

圖7 葡萄糖含量對CMCase產量的影響Fig. 7 Effect of glucose concentration on CMCase production

由因素與指標的關系圖判斷該因素的影響程度：點的分散程度越大，點的高低相差越大，任意兩點的斜率越大，則影響越顯著[24]。采用以上原則，根據關系圖上點的散布情況來分析這些因素的影響程度?？梢缘贸觯禾嫉扔绊懽铒@著，初始pH值次之，料水比第三，其他在有效因素區間影響不顯著。由此采用響應面分析料水比、碳氮比和初始pH值3 個因素對產酶的影響。

2.2 產酶條件的響應面設計與方差分析

選用A（料水比）、B（碳氮比）、C（初始pH值）3 個因素為自變量，CMCase酶活力為因變量，采用Box-Behnken設計原理進行發酵條件的優化，試驗設計及CMCase酶活力結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Experimental design and responses of Box-Behnken design

2.2.1 響應面方差分析

用Design-Expert程序對實驗數據進行分析，方差分析見表3，并得出回歸模型（1）：

由方差分析可知：模型的校正決定系數R2Adj為0.942 2，變異系數為4.58%，說明該模型只有0.597 1的變異不能由該模型解釋，因此，該模型的擬合性良好。模型的F值為30.00，P值小于0.000 1，表明該模型受外界干擾的幾率只有0.01%，是極其顯著的，模型擬合程度良好，自變量與響應值之間的線性關系顯著，可用于CMCase產量的預測和分析。

A、B、A2、B2和C2的P值均小于0.01說明其對CMCase產量影響極其顯著；而交互項AB、BC和AC對CMCase產量的影響都不顯著。

由表3的P值可以得知，在所選的各因素范圍內，對CMCase產量的影響排序為：B（碳氮比）＞A（料水比）＞C（初始pH值）。對回歸模型的回歸方程進行優化得式（2）：

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for regression equation

2.2.2 響應面交互作用分析

通過Design-Expert軟件繪制響應面曲線圖與等高線圖進行分析可進一步研究相關變量之間的交互作用以及確定最優點，結果見圖8～10。

圖8 碳氮比和料水比對CMCase酶活力的影響Fig. 8 Effects of carbon/nitrogen ratio and solid-to-liquid ratio on CMCase production

由圖8可知，碳氮比對產CMCase量的影響較為顯著，CMCase酶活力隨碳氮比的升高先升高再降低。在試驗水平范圍內，料水比和碳氮比分別在1∶3～1∶4（m/V）和20∶1～30∶1（m/m）范圍內時，CMCase酶活力可以達到試驗中的最大值。

圖9 初始pH值和料水比對CMCase酶活力的影響Fig. 9 Effects of initial medium pH and solid-to-liquid ratio on CMCase production

由圖9可知，初始pH值對CMCase產量的影響較為顯著，CMCase酶活力隨初始pH值的升高先升高再降低。在試驗水平范圍內，料水比和初始pH值分別在1∶3～1∶3.5（m/V）和3.5～4.0范圍內時，CMCase酶活力可以達到試驗中的最大值。

圖10 碳氮比和初始pH值比對CMCase酶活力的影響Fig. 10 Effects of carbon/nitrogen ratio and initial medium pH on CMCase production

由圖10可知，CMCase酶活力隨碳氮比和初始pH值的升高先升高再降低，碳氮比對CMCase酶活力的影響較初始pH值大。在試驗水平范圍內，碳氮比和初始pH值分別在20∶1～30∶1（m/m）和3.0～3.5范圍內時，CMCase酶活力可以達到試驗中的最大值。

2.2.3 驗證實驗結果

根據Design-Expert軟件分析得出3 個影響因素的最佳組合為：碳氮比25∶1（m/m）、初始pH值3.2、料水比1∶3.25（m/V），該條件下CMCase酶活力預測值為58.15 U/g。為檢驗其可靠性，在該條件下重復實驗3 次，得到CMCase酶活力為57.996 U/g，實測值與理論值基本吻合，說明響應面分析法得到的固體產酶的工藝條件真實可靠，具有一定使用價值。

3 結 論

本研究以菌株J-5為研究對象，接種于以大蒜皮為唯一碳源的產酶固體培養基，單因素試驗最佳降解條件為：氮源為硫酸銨、碳氮比20∶1（m/m）、初始pH值4.0、料水比1∶3（m/V）、發酵溫度38 ℃、發酵時間144 h、輔助碳源1 g/100 g。影響菌種產酶的因素較多，響應面法可同時對影響生物產量的因子水平及相互作用進行優化和評價，可快速確定多因子系統的最佳條件[25]。響應面試驗表明各因素的主效應關系為：B（碳氮比）＞A（料水比）＞C（初始pH值），最終最佳優化條件為：碳氮比25∶1（m/m），初始pH值3.2，料水比1∶3.25（m/V）。此條件下，CMCase酶活力預測值為58.15 U/g，驗證實驗酶活力為57.996 U/g。研究證實該菌株J-5對大蒜素等有抵抗作用，可正常生長并高效降解大蒜皮。

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Optimization of Study on Fermentation Conditions of Bacillus J-5 for Degrading Garlic Peel

LIANG Baodong1, WEI Haixiang1, JIANG Shuzhe2, YANG Yongtao1

(1. Department of Life Science and Engineering, Jining University, Qufu 273155, China; 2. College of Life Sciences, Shandong University, Jinan 250013, China)

Response surface methodology was applied to optimize the fermentation conditions of Bacillus J-5 for the production of carboxymethyl cellulase (CMCase). Firstly, the effect of medium components and culture conditions such as nitrogen source, carbon/nitrogen ratio, solid-to-liquid ratio, fermentation temperature, fermentation duration and supplementary carbon source on CMCase activity was examined by the one-factor-at-a-time method. Secondly, carbon/ nitrogen ratio, solid-to-liquid ratio and initial medium pH were selected for the investigation of their effects on CMCase activity as well as the interaction among them by response surface analysis (RSA). The optimal conditions for CMCase production were established as follows: carbon/nitrogen ratio, 25:1 (m/m); initial medium pH, 3.2; solid-to-liquid ratio, 1:3.25 (m/V), fermentation temperature, 38 ℃; fermentation duration, 144 h; and supplementary carbon source concentration, 1 g/100 g. Under these conditions, the predicted value of CMCase activity was 58.15 U/g, agreeing with the experimental value of 57.996 U/g. The high CMCase activity from Bacillus J-5 could effectively degrade garlic peel.

garlic peel; carboxymethyl cellulase; response surface analysis

10.7506/spkx1002-6630-201621034

Q939.97

A

1002-6630（2016）21-0202-07

梁寶東, 魏海香, 姜淑喆, 等. 大蒜皮降解芽孢桿菌屬細菌J-5發酵條件優化[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 202-208.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621034. http://www.spkx.net.cn

LIANG Baodong, WEI Haixiang, JIANG Shuzhe, et al. Optimization of study on fermentation conditions of Bacillus J-5 for degrading garlic peel[J]. Food Science, 2016, 37(21): 202-208. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621034. http://www.spkx.net.cn

2016-01-24

濟寧市產學研合作發展計劃項目（2014JNKJ02）

梁寶東（1979—），男，講師，碩士，研究方向為微生物發酵。E-mail：liangbaodong@126.com

1∶3.25（m/V）、發酵溫度38 ℃、發酵時間144 h、輔助碳源1 g/100 g，此條件下，CMCase酶活力預測值為58.15 U/g，

實測值為57.996 U/g。該菌株可產生較高酶活力的CMCase，可有效地降解大蒜皮。