菲律賓蛤仔對撲草凈的生物富集與消除規律

劉麗娟，王瑋云，張華威，姜向陽，任利華，姜 芳，孫靈毅

（1.山東省海洋資源與環境研究院，山東 煙臺 264006；2.煙臺市水產研究所，山東 煙臺 264003）

菲律賓蛤仔對撲草凈的生物富集與消除規律

劉麗娟1，王瑋云1，張華威1，姜向陽1，任利華1，姜 芳1，孫靈毅2,*

（1.山東省海洋資源與環境研究院，山東 煙臺 264006；2.煙臺市水產研究所，山東 煙臺 264003）

采用半靜態水質接觸染毒法，研究菲律賓蛤仔對養殖海水中撲草凈的生物富集和消除規律。生物富集實驗結果表明：在水溫（20±1） ℃條件下，在撲草凈質量濃度分別為1.0、10.0、200.0 μg/L的養殖海水中，菲律賓蛤仔中撲草凈殘留量隨所暴露海水中撲草凈質量濃度的升高而逐漸增加，二者之間呈正相關。3 個實驗組分別在第24、24、6小時達到最大富集值，最大富集系數分別為40.3、9.54、5.35。隨著時間的延長，菲律賓蛤仔的撲草凈殘留量均表現為先迅速上升，升至最高值后迅速降低，低至一定質量濃度后再次上升至一個高點然后下降，之后維持在某一質量濃度水平呈小幅波動的變化趨勢。消除實驗結果表明：在消除實驗初期，3 個實驗組菲律賓蛤仔中撲草凈的殘留量均迅速下降，24 h時降至原質量濃度的10%左右，此后下降緩慢，1.0、10.0、200.0 μg/L暴露實驗組菲律賓蛤仔的撲草凈殘留量降至10.0 μg/kg以下的時間分別為2、24、768 h，其中1.0 μg/L組在消除實驗持續96 h時檢測結果低于檢出限，其余2 組在為期45 d的消除實驗結束時仍可檢出撲草凈殘留量。研究表明，菲律賓蛤仔對撲草凈具有快速富集能力，但完全消除需要較長時間。

菲律賓蛤仔；撲草凈；富集；消除

撲草凈（prometryn）又稱撲草凈胺、捕草凈、割草佳、撲蔓盡，為均三氮苯類選擇性除草劑，化學名稱為4,6-雙異丙胺基-2-甲硫基-1,3,5-三嗪，分子式為C10H19N5S[1]。是一種高效低毒的內吸型除草劑，在農業生產中主要用于防除一年生禾本科及闊葉草[2]。20世紀70年代以來，為了控制水產養殖過程中大型綠藻的泛濫生長，以撲草凈為主要成分的除藻劑產品被應用于海水養殖生產[3]，主要用于清除魚、蝦、蟹、貝、海參等養殖水體中的絲狀藻類（青苔）、大型藻類及有害藻類。由于撲草凈在魚體內代謝情況不明，無法對食品安全性進行評價，2010年水產用撲草凈粉被列入中華人民共和國農業部公告第1435號（《獸藥試行標準廢止目錄》）中[4]。但國內某些地區仍把撲草凈作為環境改良劑在水產養殖中使用。撲草凈化學性質穩定，半衰期長，難降解，容易隨著降水、淋溶和徑流的作用由土壤遷移入水體[5]；水產養殖用撲草凈除藻后隨養殖用水直接排入大海，對海洋生態環境產生影響，同時威脅著水產品的質量安全。生活在潮間帶或近岸淺海的貝類，由于生長位置比較固定，受撲草凈污染的風險相對更高。

2014年我國海水貝類養殖產量為1 316.55萬 t，占海水養殖總產量的72.6%[6]，是最大的貝類生產國，也是重要的貝類消費國和主要的貝類出口國之一。由于我國現行有效的標準中尚沒有撲草凈安全限量相關規定[7]，缺乏對貝類中撲草凈殘留量的監管，2012年日本因檢測出從我國進口的貝類產品中撲草凈殘留超基準值（0.01 mg/kg），決定對我國產蛤蜊等雙貝殼類中撲草凈項目實施強化監控檢查[8]，此后的幾年內，我國貝類撲草凈殘留超標問題反復出現，引起人們對海產貝類撲草凈污染情況的關注。

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）俗稱花蛤、蛤蜊，廣泛分布在我國南北海區，具有生長迅速、適應性強、離水后存活時間長等優良品質，是我國四大養殖貝類之一[9]，其產品大量出口日本及東南亞國家。菲律賓蛤仔是因撲草凈殘留量超標，最早被日本列入強化監控檢查的海水貝類之一。國內外關于撲草凈對海水養殖影響的研究主要集中在對藻類的去除效果和對養殖對象的毒性方面[10-13]，貝類體內撲草凈的富集和消除規律研究鮮見報道。本研究以菲律賓蛤仔為實驗對象，研究其對養殖海水中撲草凈的生物富集及消除規律，以期為海水貝類食品安全監控和海洋環境保護提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菲律賓蛤仔取自煙臺牟平區近海，殼長2.5～3.0 cm。

乙酸乙酯（色譜純，下同）、丙酮、正己烷 德國Meker公司；環己烷 美國Tedia公司；Bong Elut石墨化碳柱（500 mg，6 mL） 美國Agilent公司；CNWBOND固相萃取小柱（500 mg/3 mL） 上海安譜科學儀器有限公司；撲草凈標準品（純度＞98.0%）德國Dr. Ehrenstorfer公司；實驗用水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

6890N/5973N氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；AccuprepMps凝膠滲透色譜儀 美國J2 Scientific公司；ASPEC XL4四通道全自動固相萃取儀 法國Gilson公司；Laborota4001旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 撲草凈富集和消除實驗

撲草凈富集、消除實驗參考文獻[14]。實驗前將菲律賓蛤仔在實驗條件下暫養3 d，每天換海水1 次，定時投喂硅藻1 次，連續充氧。暫養期間及時清除狀態不佳和死亡個體，選擇活動性強的健康菲律賓蛤仔進行實驗。實驗用海水為貝類育苗生產用水，取自煙臺蓬萊近海，經沙濾、調溫后使用，水溫（20±1） ℃，pH 7.8～8.0，鹽度30。經檢測實驗用菲律賓蛤仔和海水均不含撲草凈。設置撲草凈質量濃度為1.0、10.0、200.0 μg/L的3 個實驗組和1 個對照組（撲草凈質量濃度為0.0 μg/L），每組設置一對平行。每個實驗水箱內注入新鮮海水100 L，加入撲草凈儲備液，分別調節撲草凈質量濃度為0.0、1.0、10.0、200.0 μg/L，各放入經暫養的健康菲律賓蛤仔100 只。采用半靜態水質接觸染毒法，每24 h換一半相同撲草凈質量濃度的海水。分別在富集實驗開始6、24、48、72、96、144、240、336、432、528 h取樣，每次從每個水箱內隨機取菲律賓蛤仔5 只，分別放入標記清楚的自封口塑料袋中密封，-20 ℃冷凍保存。

富集實驗結束后進行菲律賓蛤仔體內撲草凈的消除實驗。所有實驗水箱中均換成清潔海水，分別在換水完畢后2、24、48、96、192、336、528、768、1 080 h進行取樣，投喂、取樣方法與富集實驗一致。實驗過程中及時剔除死亡的菲律賓蛤仔。富集、消除實驗在煙臺海益苗業有限公司完成。

1.3.2 撲草凈殘留量測定

標準溶液的配制：準確稱取一定量標準品，用甲醇溶解定容至100 mg/L，使用前用乙酸乙酯稀釋至所需質量濃度。取菲律賓蛤仔所有可食部分，用手動玻璃研磨器研磨勻漿后稱取5.00 g進行測定。樣品處理和測定均按照張華威等[15]的方法進行，外標法定量，用該方法測得的撲草凈檢出限為1.0 μg/kg。測定富集、消除實驗每個時間點所取菲律賓蛤仔中撲草凈的殘留量。

1.4 數據分析

檢測數據用Excel 2010軟件進行統計分析、作圖。線性回歸分析采用相關系數顯著性檢驗法進行判斷。

2 結果與分析

2.1 菲律賓蛤仔對撲草凈的生物富集規律

以撲草凈暴露質量濃度為自變量x，菲律賓蛤仔中撲草凈的殘留量為因變量y，不同富集時間的撲草凈暴露質量濃度-富集量關系線性回歸分析結果見表1。

表1 暴露質量濃度-富集量線性回歸分析Table 1 Linear regression analysis between exposure concentration and accumulation level

圖1 菲律賓蛤仔的撲草凈富集質量濃度-時間關系Fig. 1 Time-dependent accumulation of prometryn at various concentrations in Ruditapes philippinarum

查閱相關系數顯著性檢驗表[16]可知，當n＝4時，0.950≤R＜0.990表示0.01＜P≤0.05，相關性顯著；0.990≤R時表示P≤0.01，相關性極顯著。由表1可知，富集過程中除24、96 h相關系數R為顯著水平（P＜0.05）外，其他時間的相關系數均達到極顯著水平。即隨著海水暴露質量濃度的增加，菲律賓蛤仔中撲草凈的殘留量相應增加，二者呈顯著正相關關系。

由圖1可知，在528 h的富集實驗過程中，菲律賓蛤仔中撲草凈殘留量表現為先迅速升至最高值后迅速降低，低至一定質量濃度后再次上升至一個高點，然后下降，之后維持在某一水平小幅波動的變化趨勢。菲律賓蛤仔體內撲草凈殘留量在96～144 h達到基本穩定狀態。528 h富集實驗結束時，菲律賓蛤仔中撲草凈殘留量分別為17.3、55.1、615 μg/kg，為撲草凈暴露質量濃度的17.3、5.51、3.075 倍。富集最高值分別為40.3、95.4、1 070 μg/kg，分別為相應撲草凈暴露質量濃度的40.3、9.54、5.35 倍，達到最高值所需時間分別為24、24、6 h，顯示菲律賓蛤仔對撲草凈具有快速富集效應。

圖2 菲律賓蛤仔在撲草凈不同暴露質量濃度下的富集系數-時間關系Fig. 2 Time-dependent bioconcentration factors of prometryn at various concentrations in Ruditapes philippinarum

由圖2可知，隨著養殖海水中撲草凈暴露質量濃度的升高，菲律賓蛤仔的富集系數逐步下降，即暴露質量濃度越低，富集系數越高；暴露質量濃度越高，富集系數越低。這與菲律賓蛤仔和淡水貝類對阿特拉津的富集規律一致[17-18]，與刺參對撲草凈的生物富集現象相同[19]。3 個實驗組中菲律賓蛤仔對撲草凈的富集系數總體變化趨勢相同，均表現為先升高后下降、低至一定數值后再次上升至一個高點然后下降，之后基本維持在某一水平小幅波動。

2.2 菲律賓蛤仔對撲草凈的消除

圖3 消除階段菲律賓蛤仔中撲草凈的質量濃度-時間關系Fig. 3 Time-dependent elimination of prometryn accumulated at various concentrations from Ruditapes philippinarum

由圖3可知，在消除實驗過程中，3 個實驗組均表現出初始階段菲律賓蛤仔中撲草凈殘留量迅速下降，消除24 h時降至撲草凈原殘留量的10%左右，以后緩慢下降的趨勢。其中撲草凈暴露質量濃度為1.0 μg/L的實驗組，消除實驗菲律賓蛤仔中撲草凈原殘留量為17.3 μg/kg，消除持續2 h時菲律賓蛤仔中撲草凈殘留量為2.99 μg/kg，96 h時檢測結果低于檢出限；撲草凈暴露質量濃度為10.0 μg/L的實驗組，消除實驗菲律賓蛤仔中撲草凈原殘留量為55.1 μg/kg，消除持續24 h時菲律賓蛤仔中撲草凈殘留量為6.41 μg/kg；撲草凈暴露質量濃度為200.0 μg/L的實驗組，消除實驗菲律賓蛤仔中撲草凈原殘留量為615 μg/kg，消除持續768 h時菲律賓蛤仔中撲草凈殘留量為8.97 μg/kg。3 個實驗組分別在消除2、24、768 h后菲律賓蛤仔中撲草凈殘留量一直保持低于日本要求的基準值0.01 mg/kg（10 μg/kg）。撲草凈暴露質量濃度為10.0、200.0 μg/L的2 個實驗組在為期1 080 h的消除實驗結束時仍可檢出撲草凈。該結果與田秀慧等[19]對刺參的研究結果基本一致，但菲律賓蛤仔對撲草凈的消除速率要稍高于刺參。

3 討 論

3.1 菲律賓蛤仔對撲草凈的富集能力

Pacakova等[20]采用化學品的正辛醇/水分配系數（Kow）的對數值lgKow值來估計其在生物體中的生物富集效果。有研究發現，lgKow值在2～6之間的化合物易于在生物體內富集。撲草凈lgKow值為2.99[21]，顯示出撲草凈易于在生物體內富集。研究數據顯示，在撲草凈暴露質量濃度為1.0、10.0、200.0 μg/L時，菲律賓蛤仔的最大富集系數分別為40.3、9.54、5.35，遠高于相同暴露質量濃度下刺參對撲草凈的最大富集系數4.70、4.38、3.37[19]，可見不同水生生物對撲草凈的富集能力差別很大，菲律賓蛤仔對撲草凈的富集能力明顯高于刺參；而相同暴露質量濃度下菲律賓蛤仔對阿特拉津的最大富集系數分別為15.4、6.15、3.56[17]，可見菲律賓蛤仔對撲草凈富集能力高于阿特拉津，這與撲草凈的lgKow（2.99）[21]高于阿特拉津的lgKow（2.7）[20]，更易于在生物體內富集的特性一致。

菲律賓蛤仔對撲草凈的富集速率快、富集系數高，可能與其攝食方式有關。菲律賓蛤仔為濾食性生物，直接濾食海水中的浮游藻類為食物。浮游藻類具有巨大的總表面積、特殊胞外組分及細胞形態，對農藥具有很高的富集能力[22]。通過食物鏈的傳遞，撲草凈在菲律賓蛤仔中快速富集。并且菲律賓蛤仔具有開放式循環系統[23]，與外來物質的接觸較為充分，因此在富集實驗階段會很快到達峰值。

3.2 菲律賓蛤仔對撲草凈的富集和代謝

研究表明，撲草凈在動物中的代謝途徑包括N-脫烷基作用、伴有水解作用和/或氨基酸結合作用，而目前動物中最受關注的殘留還是撲草凈母體[2]。富集實驗初期，菲律賓蛤仔中撲草凈殘留量隨時間大幅波動，先后出現2 個峰值，之后維持在某一水平小幅波動。這可能是因為菲律賓蛤仔體內由撲草凈的富集引發一系列復雜的生化反應所致。由于富集效應，菲律賓蛤仔體內撲草凈殘留量隨時間推移迅速上升，啟動了菲律賓蛤仔體內的撲草凈代謝途徑，且其代謝效率隨著撲草凈殘留量的升高而提高，但在短時間內撲草凈的富集效率遠高于代謝效率，表現為殘留量的快速增加；隨著體內撲草凈殘留量的升高，代謝效率也不斷提高，在殘留量達到最高值時，代謝效率達到最高，此時已遠高于富集效率，表現為殘留量快速下降；代謝效率隨著撲草凈殘留量的下降逐漸降低，在低于其富集效率時又表現為撲草凈殘留量的升高；由于對環境的適應，菲律賓蛤仔對撲草凈的富集和代謝效率達到動態平衡，表現為撲草凈殘留量基本達到穩定狀態。消除實驗階段，海水中撲草凈殘留量的突然降低，打破了菲律賓蛤仔對撲草凈的富集-代謝平衡，由于富集效率接近于零，而代謝效率繼續維持在較高水平，導致撲草凈殘留量的急速下降；隨著體內撲草凈殘留量的減少，菲律賓蛤仔對撲草凈的代謝效率也逐漸下降，其體內撲草凈消除趨緩。

3.3 菲律賓蛤仔的撲草凈安全風險

撲草凈對人體健康的影響不明顯，但對大多數的水生動物具有輕微至中等毒性，對水生植物具有高毒性[24]。本研究發現，菲律賓蛤仔中撲草凈殘留量越高，完全消除所需時間越長。徐英江等[25]研究發現萊州灣海域表層海水中撲草凈質量濃度為未檢出至21.2 ng/L；本課題組對乳山、廣饒海域調查結果顯示，該海域海水中撲草凈質量濃度均遠低于1 μg/L，隨污染的徑流和池塘養殖用水排入海中的撲草凈在海水的稀釋和自凈作用下其質量濃度通常遠低于1 μg/L，在此海域生長的菲律賓蛤仔撲草凈殘留量應該在17.3 μg/kg以下。由于采捕的菲律賓蛤仔食用前為排凈體內的泥沙，需在潔凈海水中暫養2 h左右，在此期間菲律賓蛤仔中撲草凈被迅速凈化。結合本實驗結果推測，在自然海區中生長的菲律賓蛤仔，經過2 h凈化后不存在食用安全風險。但要驗證該推測的準確性，還需要對不同養殖區菲律賓蛤仔的撲草凈殘留量基礎數據進行調查。

4 結 論

本研究結果顯示，在水溫（20±1） ℃條件下，在撲草凈暴露質量濃度分別為1.0、10.0、200.0 μg/L的養殖海水中，菲律賓蛤仔中撲草凈殘留量隨所暴露質量濃度的升高而逐步增加，二者之間呈顯著正相關關系。3 個實驗組分別在第24、24、6小時達到富集最大值，最大富集系數分別為40.3、9.54、5.35。富集實驗階段，3 個實驗組菲律賓蛤仔的撲草凈殘留量均表現為隨著時間延長先迅速升至最高值后迅速降低，低至一定質量濃度后再次上升至一個高點然后下降，在96～120 h達到基本穩定狀態，3 個實驗組分別維持在17.3、55.1、615 μg/kg水平小幅波動，其富集系數隨撲草凈暴露質量濃度的升高而下降。消除實驗開始階段菲律賓蛤仔中撲草凈的殘留量迅速下降，24 h時近90%的撲草凈被凈化，此后消除效率下降。各實驗組菲律賓蛤仔的撲草凈殘留量降至10.0 μg/kg以下的時間分別為2、24、768 h，原質量濃度越高，所需消除時間越長，其中撲草凈暴露質量濃度為1.0 μg/L在消除實驗持續96 h時檢測結果低于檢出限，其他2 組在為期1 080 h的消除實驗結束時仍可檢出撲草凈殘留。可見菲律賓蛤仔對撲草凈具有快速、高效富集能力和快速消除能力，但徹底消除所需時間較長。

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Accumulation and Elimination of Prometryn in Ruditapes philippinarum

LIU Lijuan1, WANG Weiyun1, ZHANG Huawei1, JIANG Xiangyang1, REN Lihua1, JIANG Fang1, SUN Lingyi2,*
(1. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 2. Yantai Aquatic Products Research Institute, Yantai 264003, China)

The accumulation and elimination of prometryn in Ruditapes philippinarum was studied by the semistatic method. Ruditapes philippinarum were exposed to seawaters containing 1.0, 10.0 and 200.0 μg/L prometryn at (20 ± 1) ℃, respectively. The amount of residual prometryn in Ruditapes philippinarum increased with the increase in prometryn concentration. The maximum accumulation of prometryn in Ruditapes philippinarum at the three concentrations was found after exposure for 24, 24 and 6 h with bioconcentration factors of 40.3, 9.54 and 5.35, respectively. As exposure time increased, prometryn at each concentration could be rapidly accumulated in Ruditapes philippinarum and then reduced, and after another cycle, finally kept fluctuating slightly around a certain level. The amount of residual prometryn in Ruditapes philippinarum from all three concentration groups rapidly dropped during the early stage of elimination, reaching around 10% of the initial level after 24 h, and then fell slowly. The amount of prometryn residue in the 1.0, 10.0 and 200.0 μg/L exposure groups was reduced to below 10.0 μg/kg after 2, 24 and 768 h, respectively. Moreover, the 1.0 μg/L exposure group reached an undetectable level after 96 h, whereas the two other groups were still detectable after 45 days. This research suggested that Ruditapes philippinarum can accumulate prometryn rapidly, but its complete elimination will take a long time.

Ruditapes philippinarum; prometryn; accumulation; elimination

10.7506/spkx1002-6630-201621043

S917.4

A

1002-6630（2016）21-0252-05

劉麗娟, 王瑋云, 張華威, 等. 菲律賓蛤仔對撲草凈的生物富集與消除規律[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 252-256.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621043. http://www.spkx.net.cn

LIU Lijuan, WANG Weiyun, ZHANG Huawei, et al. Accumulation and elimination of prometryn in Ruditapes philippinarum[J]. Food Science, 2016, 37(21): 252-256. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621043. http://www.spkx.net.cn

2016-03-03

煙臺市科技發展計劃項目（2013NC334）；山東省現代農業產業技術體系貝類創新團隊項目（SDAIT-14-08）

劉麗娟（1977—），女，副研究員，碩士，研究方向為海洋生物多樣性和水產品質量安全。

E-mail：liu_li_juan_426@aliyun.com

*通信作者：孫靈毅（1963—），女，研究員，學士，研究方向為水產食品安全。E-mail：sunly1963@163.com