螃蟹腳全粉的急性毒性和遺傳毒性

郝彬秀，應(yīng) 劍，孟慶佳，王黎明，劉 婷，李 頌，王春玲

（中糧營養(yǎng)健康研究院，北京 102209）

螃蟹腳全粉的急性毒性和遺傳毒性

郝彬秀，應(yīng) 劍，孟慶佳，王黎明，劉 婷，李 頌，王春玲*

（中糧營養(yǎng)健康研究院，北京 102209）

參考2015年實施的GB 15193.1—2014《食品安全性毒理學(xué)評價程序》的實驗方法，采用急性毒性實驗、骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實驗、精原細(xì)胞染色體畸變實驗和Ames實驗，觀察螃蟹腳全粉的急性毒性和遺傳毒性作用。結(jié)果：螃蟹腳全粉對雌、雄性大鼠經(jīng)口半數(shù)致死量（medium lethal dose，LD50）均為10.25 g/kg，屬實際無毒級；骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實驗和Ames實驗結(jié)果均為陰性；精原細(xì)胞染色體畸變實驗表明，10.25 g/kg和5.12 g/kg的螃蟹腳全粉可能引起染色體一過性的畸變率升高，2.57 g/kg未觀察到該現(xiàn)象。結(jié)論：螃蟹腳全粉未顯示存在急性毒性，未觀察到明確的遺傳毒性。

螃蟹腳；急性毒性；骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實驗；精原細(xì)胞染色體畸變實驗；Ames實驗；全粉

螃蟹腳系桑寄生科槲寄生屬植物，是一種寄生在樹齡較高的古喬木茶樹上的寄生物，形狀像小珊瑚，寄生枝桿節(jié)狀，形如蟹肢而得名[1]。螃蟹腳學(xué)名楓香槲寄生（Viscum liquidambaricolum Hayata），也有人稱其為扁枝槲寄生。因寄生于茶樹，又被稱為“茶茸”[2]。

螃蟹腳從清朝起即是云南景邁地區(qū)普洱茶出口外銷和進(jìn)貢的特殊標(biāo)記[3-5]。如今，螃蟹腳在云南的少數(shù)民族地區(qū)被認(rèn)為是珍貴的食用植物，每次食用量為1～2 g，可以單獨(dú)飲用或者與普洱茶共飲，也用作燉滋補(bǔ)雞湯的食材[6]。《云南茶典》認(rèn)為螃蟹腳具有清熱解毒、健胃消食、清膽利尿、降低血壓等功效[2,7]。現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，螃蟹腳主要有效成分為多糖、黃酮、蛋白質(zhì)、三萜、生物堿等化合物，其提取物具有抗菌、抗腫瘤等藥理活性，民間用其治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)疼痛、腰肌勞損[6,8-12]。然而，目前的研究僅限于對螃蟹腳的成分分析上，對于其食用的安全性情況鮮見文獻(xiàn)和研究成果，只在民間流傳有“性涼，不可多喝”的說法[3-5]。

為了確認(rèn)螃蟹腳是否可以作為食品進(jìn)行開發(fā)，本實驗對螃蟹腳全粉的急性毒性和遺傳毒性進(jìn)行研究，為對其安全性研究提供初步依據(jù)，并為其合理開發(fā)和進(jìn)一步利用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螃蟹腳全粉由中國土產(chǎn)畜產(chǎn)進(jìn)出口總公司提供，目數(shù)為180 目，黃褐色粉末，具有甘甜香氣，味甘。

清潔級SD（Sprague Dawley）大鼠和ICR（Institute of Cancer Research）小鼠，購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物實驗生產(chǎn)許可證編號：SCXK（京）2012-0001；實驗動物質(zhì)量合格證編號分別為SD大鼠（急性毒性實驗）：No.11400700100902；ICR小鼠（骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實驗）：No.11400700108380；ICR小鼠（精原細(xì)胞染色體畸變實驗）：No. 11400700109805。所有動物實驗前在環(huán)境中適應(yīng)3 d，并進(jìn)行檢疫觀察。動物實驗經(jīng)中國疾控預(yù)防中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所實驗動物管理與福利倫理審查委員會審查決議通過，倫理審查批準(zhǔn)號：EAWE-2015-006。實驗動物使用許可證編號：SYXK（京）2014-0043。

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535，由上海君科生物科技有限公司代理購自美國Moltox公司。對其基因型、自發(fā)回復(fù)突變數(shù)和對陽性致突變物敏感性進(jìn)行鑒定，5 株菌株特性經(jīng)鑒定達(dá)到實驗要求。

牛肉膏、胰蛋白胨、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；磷酸氫鈉銨、檸檬酸、硫酸鎂、葡萄糖、敵克松 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-氨基芴、1,8-二羥蒽醌、L-組氨酸、D-生物素、氧化型輔酶Ⅱ、葡萄糖-6-磷酸鈉鹽、疊氮鈉 美國Sigma-Aldrich公司；氯化鎂、氯化鉀 西隴化工有限公司；SD大鼠肝S9 美國Moltox公司；所有溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Axio Lab.A1顯微鏡 德國卡爾蔡司公司；Galaxy 230菌落計數(shù)器 德國Wiggens公司。

1.3 方法

1.3.1 急性毒性實驗

取SD大鼠20 只，雌雄各半，體質(zhì)量190～220 g，采用限量法進(jìn)行實驗。用0.5%羧甲基纖維素鈉配制全粉懸液，最大灌胃劑量為10.25 g/kg。灌胃后對動物進(jìn)行臨床觀察及體質(zhì)量檢測，記錄不良反應(yīng)、死亡情況。如有死亡，進(jìn)行解剖并進(jìn)行肉眼病理觀察。連續(xù)觀察2 周，第15天處死所有動物，解剖并進(jìn)行肉眼病理觀察[13-16]。

1.3.2 骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實驗

取ICR小鼠50 只，雌雄各半，體質(zhì)量25～35 g，隨機(jī)分為5 組，設(shè)陰性對照組、陽性對照組和3 個不同劑量實驗組。以急性毒性實驗中螃蟹腳全粉的最大劑量10.25 g/kg為最高劑量，下設(shè)1/2（即5.12 g/kg）和1/4（即2.57 g/kg）劑量組，分別在0 h和24 h經(jīng)口灌胃給予受試物。陰性對照組經(jīng)口灌服0.5%羧甲基纖維素鈉，陽性對照組于0 h腹腔注射40 mg/kg環(huán)磷酰胺。30 h將小鼠脫頸處死，采集股骨骨髓，制備細(xì)胞涂片，Gimesa染色后鏡檢。嗜多染紅細(xì)胞呈灰藍(lán)色，成熟正染紅細(xì)胞呈紅色，每只小鼠觀察2 000 個嗜多染紅細(xì)胞，記錄含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，計算微核率（micronucleus frequency，MNF）[17-18]。

1.3.3 精原細(xì)胞染色體畸變實驗

取雄性ICR小鼠35 只，體質(zhì)量25～35 g，隨機(jī)分為7 組，設(shè)陰性對照組（2 組）、陽性對照組（1 組）和不同劑量實驗組（其中高劑量組為2 組，中劑量和低劑量組各1 組）。以急性毒性實驗中螃蟹腳全粉的最大劑量10.25 g/kg為最高劑量，下設(shè)1/2（即5.12 g/kg）和1/4（即2.57 g/kg）劑量組。陰性對照組經(jīng)口灌服0.5%羧甲基纖維素鈉，陽性對照組一次性腹腔注射40 mg/kg環(huán)磷酰胺。其中1 組陰性對照組和高劑量組，以及陽性對照組、中劑量組和低劑量組的動物于24 h脫頸處死采樣，剩余的1 組陰性對照組和高劑量組的動物在觀察48 h后脫頸處死采樣。動物處死前3～5 h腹腔注射秋水仙素6 mg/kg。取小鼠雙側(cè)睪丸，分離睪丸曲細(xì)精管，用1%檸檬酸三鈉溶液處理后進(jìn)行固定、軟化、離心，制備細(xì)胞懸液滴片，Giema染色后鏡檢。每只小鼠觀察100～200 個中期分裂相精原細(xì)胞，記錄染色體結(jié)構(gòu)畸變的細(xì)胞數(shù)和染色體畸變類型，計算染色體畸變頻率，并與溶媒組進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析比較[19-20]。

1.3.4 Ames實驗

實驗采用平板摻入法。預(yù)實驗顯示螃蟹腳全粉添加量為5 000 μg/皿時，有較明顯的抑菌現(xiàn)象，故實驗以3 000 μg/皿為最大劑量，采用等比組距，以倍為組距，下設(shè)950、300、95、30 μg/皿劑量組。同時設(shè)立溶劑對照組、陰性對照組和陽性對照組，以二甲基亞砜為溶劑對照組，以自發(fā)回復(fù)突變數(shù)為陰性對照，以疊氮鈉（1.5 μg/皿，不加S9的TA100和TA1535）、敵克松（50 μg/皿，不加S9的TA97、TA98、TA102）、2-氨基芴(10 μg/皿，加S9的TA97、TA98、TA100)、1,8-二氫蒽醌（50 μg/皿，加S9的TA102）、環(huán)磷酰胺（200 μg/皿，加S9的TA1535）為陽性對照。在加入S9和不加入S9條件下進(jìn)行實驗。每個菌株每個劑量設(shè)3 個平板。計數(shù)回復(fù)突變菌落數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。菌株TA98和TA1535的回復(fù)突變菌落數(shù)等于或大于陰性對照組回復(fù)突變菌落數(shù)的2 倍可判定為陽性結(jié)果；菌株TA97a、TA100和TA102的回復(fù)突變菌落數(shù)等于或大于陰性對照組回復(fù)突變菌落數(shù)的2 倍，且有劑量反應(yīng)或某一測試點(diǎn)有可重復(fù)陽性結(jié)果，可判定為陽性結(jié)果[21-24]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實驗結(jié)果

實驗期間未見大鼠出現(xiàn)中毒癥狀，無動物死亡，各組大鼠外觀特征基本正常。雄性組大鼠在給予螃蟹腳全粉后出現(xiàn)極顯著的一過性體質(zhì)量下降，但在48 h后即恢復(fù)正常的體質(zhì)量增長，推測為大量給予食物導(dǎo)致暫時的胃腸道不適。于第15天處死動物，進(jìn)行病理解剖，均未觀察到異常。實驗結(jié)果顯示大鼠急性毒性實驗LD50大于10.25 g/kg。據(jù)此判斷螃蟹腳全粉的急性毒性屬于實際無毒。實驗期間SD大鼠體質(zhì)量變化如表1所示。

表1 大鼠急性毒性實驗結(jié)果Table 1 Results of acute toxicity in SD rats

2.2 骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實驗結(jié)果

螃蟹腳全粉在2.57、5.12、10.25 g/kg劑量下，雄性小鼠和雌性小鼠的嗜多染紅細(xì)胞微核率與陰性對照組均無顯著差異（P＞0.05），且無劑量-反應(yīng)關(guān)系；陽性對照組與陰性對照組相比差異極顯著（P＜0.01），見表2、圖1。表明在本實驗條件下，螃蟹腳全粉無致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成的作用。

表2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實驗結(jié)果Table 2 Results of micronucleus test of bone marrow PCE cells in mice

圖1 嗜多染紅細(xì)胞微核實驗結(jié)果（×1 000）Fig. 1 Polychromatic erythrocytes (×1 000)

2.3 精原細(xì)胞染色體畸變實驗結(jié)果

螃蟹腳全粉在2.57、5.12、10.25 g/kg劑量下，陽性對照組與24 h和48 h的陰性對照組相比差異顯著（P＜0.05）。24 h的低劑量組與陰性對照組相比無顯著性差異，高、中劑量組與陰性對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）；48 h的高劑量組與陰性對照組相比，無顯著性差異（P＞0.05），見表3、圖2。表明在本實驗條件下，灌胃給予較高劑量的螃蟹腳全粉，可能一過性地促進(jìn)小鼠精原細(xì)胞染色體畸變。

表3 小鼠精原細(xì)胞染色體畸變實驗結(jié)果Table 3 Results of spermatogonium chromosome aberration in mice

圖2 精原細(xì)胞染色體畸變情況（×1 000）Fig. 2 Sperm cell chromosome aberration (×1 000)

2.4 Ames實驗結(jié)果

實驗各劑量組的回復(fù)突變菌落數(shù)，不論是否加入S9，均未超過相應(yīng)陰性對照組的2 倍，且無劑量-反應(yīng)關(guān)系；陽性對照組超過陰性對照組2 倍以上，顯示出明顯的誘變性，結(jié)果見表4。表明在實驗劑量范圍內(nèi)，加或不加S9條件下，螃蟹腳全粉對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型的5 株菌株均無致突變作用。

表4 Ames實驗結(jié)果Table 4 Results of Ames tests

3 討論

本實驗以2015年5月1日開始實施的GB 15193.1—2014《食品安全性毒理學(xué)評價程序》[25]為標(biāo)準(zhǔn)，對螃蟹腳全粉開展了急性毒性和遺傳毒性實驗。在急性毒性實驗中，實驗結(jié)果顯示螃蟹腳全粉的LD50大于最大耐受劑量10.25 g/kg，屬于實際無毒（LD50＞5 g/kg），符合食品安全的要求。在遺傳毒性實驗中，Ames實驗、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實驗均為陰性，表明在實驗劑量下，未觀察到螃蟹腳全粉有遺傳毒性作用。在精原細(xì)胞染色體畸變實驗中，24 h觀察到高中劑量組染色體畸變率升高，但該現(xiàn)象是一過性的，在48 h高劑量組未觀察到。與Ames實驗、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實驗相比，精原細(xì)胞染色體畸變實驗存在一定隨機(jī)誤差，因此下一步將通過其他實驗確認(rèn)是否存在遺傳毒性。

綜上，螃蟹腳全粉無急性毒性；未觀察到明確的遺傳毒性，可以通過其他毒理實驗方法進(jìn)行論證。

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Acute and Genetic Toxicity of Whole Powder of Viscum liquidambaricolum Hayata

HAO Binxiu, YING Jian, MENG Qingjia, WANG Liming, LIU Ting, LI Song, WANG Chunling*
(COFCO Nutrition and Health Research Institute, Beijing 102209, China)

The acute and genetic toxicity of whole powder of Viscum liquidambaricolum Hayata were evaluated using acute toxicity, bone marrow polychromatic erythrocyte micronucleus, mouse spermatogonium chromosome aberration and Ames tests as described in the Chinese national standard Toxicological Evaluation Procedure for Food Safety (GB 15193.1-2014). The oral acute toxicity test revealed that the medium lethal dose (LD50) of the powder was 10.25 g/kg for both male and female rats, which suggested that it was actually non-toxic. Both bone marrow polychromatic erythrocyte micronucleus and Ames tests gave negative results. Spermatogonium chromosome aberration tests at 10.25 and 5.12 g/kg doses revealed temporarily high aberration rate, which was not observed in the 2.57 g/kg group. Therefore, whole powder of Viscum liquidambaricolum Hayata showed neither acute nor genetic toxicity.

Viscum liquidambaricolum Hayata; acute toxicity; bone marrow polychromatic erythrocyte micronucleus test; spermatogonium chromosome aberration test; Ames test; whole powder

10.7506/spkx1002-6630-201621042

R114

A

1002-6630（2016）21-0248-04

郝彬秀, 應(yīng)劍, 孟慶佳, 等. 螃蟹腳全粉的急性毒性和遺傳毒性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 248-251. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201621042. http://www.spkx.net.cn

HAO Binxiu, YING Jian, MENG Qingjia, et al. Acute and genetic toxicity of whole powder of Viscum liquidambaricolum Hayata[J]. Food Science, 2016, 37(21): 248-251. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621042. http://www.spkx.net.cn

2015-12-23

北京市科技計劃項目（161100000616012）

郝彬秀（1987—），女，工程師，碩士，研究方向為食品安全與功效。E-mail：haobx@cofco.com

*通信作者：王春玲（1972—），女，高級工程師，博士，研究方向為營養(yǎng)學(xué)。E-mail：wangchunling@cofco.com