電化學傳感器在H2O2檢測中的應用

張軍麗，李瑞玲，潘慶才

(黃淮學院 化學與制藥工程學院，河南 駐馬店 463000 )

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電化學傳感器在H2O2檢測中的應用

張軍麗*，李瑞玲，潘慶才

(黃淮學院 化學與制藥工程學院，河南 駐馬店 463000 )

將辣根過氧化酶(HRP)固定在殼聚糖(CTS) -羧基化多壁碳納米管(C-MWNTs)復合物修飾的玻碳電極(GCE)表面，制得殼聚糖-羧基化多壁碳納米管(HRP-CTS/C-MWNTs/GCE)電化學傳感器。采用傅立葉變換紅外光譜儀檢測復合物包埋的HRP，發現其結構性質未發生改變；采用循環伏安法對該電極的電化學性能進行研究，結果表明：在1/15 mol·L-1的PBS(pH 6.98)緩沖溶液中出現1對氧化還原峰，傳感器對過氧化氫有良好的電催化還原作用。過氧化氫濃度在0.1～12 mmol·L-1范圍內與還原峰電流呈線性關系，相關系數(r)為0.998 6，并檢測出市售醫用雙氧水的平均含量為2.93%。

殼聚糖；羧基化多壁碳納米管；辣根過氧化物酶；電化學傳感器；過氧化氫

多壁碳納米管具有高的金屬性、獨特的電子傳導性及電催化性能，并具有大的比表面積以及良好的生物兼容性，是優越的電子傳遞媒介，易與周圍的其它物質發生電子傳遞作用，已用于促進生物傳感器的電活性，從而被廣泛用于各種領域[1-5]。羧基化多壁碳納米管是經酸化處理后，其開口端和外表面含有一定數量的活性基團(如羥基、羧基等)，大大提高了碳納米管的電催化能力[6]。生物傳感器是用固定的生物材料作為敏感元件，電極作為轉換元件，以電勢或電流為特征檢測信號[7-8]。殼聚糖分子內同時含有氨基和羥基，具有優異的成膜性，良好的水通透性，無毒，具有模板的記憶能力和選擇吸附性能，以及良好的生物相容性而被用于生物傳感器的構建[9]，并將其用于過氧化氫含量的測定[10-16]。以往應用殼聚糖、多壁碳納米管和HRP修飾電極時，大多采取簡單混合的方法，而本文采用循環伏安電化學分析法，利用羧基化的多壁碳納米管帶負電荷與帶正電荷的殼聚糖之間存在靜電吸附及生物相容性，將辣根過氧化物酶包埋固定在殼聚糖-羧基化多壁碳納米管復合膜上，制備了HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電化學傳感器，對痕量過氧化氫的電化學性能進行研究，并測定了市售雙氧水的含量。結果表明，HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極對H2O2的電催化氧化效果相比于裸玻碳電極有較大提高，為快速、準確檢測生活用品和食品中H2O2的含量提供了可能。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Zennium電化學工作站(德國Zahner公司)；三電極系統：參比電極為飽和甘汞電極，輔助電極為鉑絲電極，工作電極為HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極。FTIR 表征采用Tensor27 型傅立葉變換紅外光譜議(德國Bruker 公司);殼聚糖(分析純，脫乙酰度96%，恒臺縣金湖甲殼制品有限公司)；辣根過氧化物酶(生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司)；過氧化氫(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)；羧基化多壁碳納米管(<50 nm，中科院成都有機化學研究所)。其它試劑均為分析純。

1.2 HRP-CTS/C-MWNTs/GCE的制備

稱取0.1 g殼聚糖放入10 mL 體積分數為1%的乙酸溶液中溶解，再加入C-MWNTs在超聲波振蕩30 min使其完全分散。磁力攪拌器攪拌2 h，得到均勻的多壁碳納米管殼聚糖復合膜溶液。用移液槍移取復合膜溶液滴涂在干凈的玻碳電極表面，自然條件下晾干備用，在晾干的玻碳電極表面滴涂辣根過氧化物酶溶液，然后將制得的HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極放在冰箱中24 h晾干備用。

2 結果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖1 C-MWNTs(a)、自由狀態下的HRP(b)與 HRP-CTS/C-MWNTs(c)的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of C-MWNTs(a),free state HRP(b) and HRP-CTS/C-MWNTs(c)

圖2 不同電極的循環伏安圖Fig.2 CV curves for different modified electrodesa：GCE;b：CTS/C-MWNTs/GC;c：HRP-CTS/C-MWNTs/GCE

圖1曲線a為羧基化多壁碳納米管(C-MWNTs)的紅外光譜，納米管表面引進了羧基(1 641.7 cm-1)、羧基根基團(1 400.7 cm-1)和羥基(1 111.3 cm-1)等官能團。這些官能團提供了一種穩定的親水環境，同時保持酶的活性，為酶促反應提供了穩定的微環境。由曲線b和c可知：在CTS-C-MWNTs復合物膜上固定的HRP的酰胺峰(1 650.3 cm-1)和(1 750.7 cm-1)，與自由狀態下的HRP酰胺峰(1 650.3 cm-1)和(1 739.1 cm-1)相差較小，這說明復合物膜修飾電極固定的HRP結構性質未發生改變。

2.2 MWNTs和CTS對HRP直接電子轉移的促進作用

2.2.1 不同修飾電極的循環伏安圖 在PBS緩沖溶液(pH 6.98)，掃描速率80 mV/s的條件下，采用不同修飾電極對同一PBS緩沖溶液進行循環伏安掃描(見圖2)。可觀察到裸GCE電極在掃描電壓范圍內未出現氧化還原峰，說明裸GCE電極對PBS的催化作用不明顯(曲線a)。在GCE電極表面修飾上CTS-C-MWNTs復合膜后的循環伏安曲線，在電位-0.3 V附近出現氧化峰，但還原峰不明顯，說明修飾上復合物膜之后的電極對PBS緩沖溶液的催化作用不明顯(曲線b)。而在電極表面修飾上復合物膜之后固定HRP(HRP-CTS/C-MWNTs/GCE)進行掃描，可觀察到1對較為明顯的氧化還原峰(曲線c)，這對氧化還原峰是由HRP的電子轉移反應產生，為HRP血紅素的輔基中氧化還原中心Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)的氧化還原峰，其峰電流也有了較大的提高，表明對電極進行修飾可以提高電極的靈敏性。

圖3 pH 值對傳感器響應電流的影響Fig.3 Effect of pH value on response current of electrode

圖4 不同修飾電極對H2O2測定的循環伏安曲線Fig.4 CVs of different modified electrodes to H2O2a.GCE;b.CTS/C-MWNTs/GCE;c.HRP-CTS/C-MWNTs/GCE

2.2.2 pH值對HRP-CTS/C-MWNTs/GCE測定的影響 在80 mV/s的掃描速率下，改變溶液pH值，研究不同pH值對PBS緩沖溶液在電極上電化學行為的影響。結果顯示，pH值對PBS緩沖溶液在HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極的電化學行為影響較大，在pH值為6.98時有最大峰電流，pH值大于或小于6.98時，均會導致峰電流降低。這可能是因為酶的活性大小與酶所處的環境有關，實驗選擇最佳pH值為6.98。

2.2.3 掃描速率對HRP-CTS/C-MWNTs/GCE測定的影響 取1/15 mol·L-1的PBS緩沖溶液(pH 6.98) 20 mL，在不同掃描速率下進行測定，考察了掃描速率的影響。結果顯示，在不同的掃描速率條件下氧化電位幾乎無變化，說明該電極的可逆性較好。隨著掃描速率的增大，氧化峰電流Ipa增大，且氧化峰電流與掃描速率(v,mV/s)呈線性關系，表明該過程主要受吸附控制，線性方程為Ipa=0.020 0v-0.347 5，相關系數(r)為0.971 4。

2.3 HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極

對H2O2催化性能的研究

2.3.1 不同修飾電極對H2O2催化性能的研究 由圖4可知，不同的修飾電極對測定10 mmol·L-1H2O2的靈敏度不同。裸GCE對H2O2底物幾乎無催化氧化作用(曲線a)；CTS/C-MWNTs/GCE的循環伏安曲線，雖然可以觀察到其對H2O2的催化作用，但無明顯的還原峰(曲線b)；而在HRP-CTS/C-MWNTs/GCE的循環伏安曲線上，可觀察到H2O2的還原電流明顯增大(曲線c)，表明修飾后電極對H2O2具有良好的電催化性能。2.3.2 底物濃度對酶修飾電極測定的影響 研究了底物濃度對HRP催化活性的影響，用HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極在pH 6.98，掃速80 mV/s的條件下對不同濃度的H2O2進行測定(見圖5)。結果表明，加底物H2O2后，修飾電極的氧化峰電流Ipa急劇減小，而還原峰電流Ipc急劇增大，這種還原峰電流的產生是由于HRP的催化還原H2O2引起，表明HRP對底物的性質有一定的選擇性，且還原峰電流隨著H2O2的濃度增大而增大，在0.1～12 mmol·L-1范圍內濃度與還原峰電流呈線性關系：Ipc=3.439 2×10-6c-1.177 1×10-6，r=0.998 6。由3倍信噪比計算出檢出限為0.05 mmol·L-1，達到穩態電流的95%所需時間約為16 s。

圖5 不同濃度的過氧化氫溶液在HRP-CTS/C-MWNTs/GCE上的循環伏安圖Fig.5 CVs of different concentration of H2O2at HRP-CTS/C-MWNTs/GCE concentration of H2O2(a-e):0,4,6,8,10 mmol/L;1/15 mol/L PBS buffer，pH 6.98;insert:fitting curve of biosensor for detecting H2O2

2.4 修飾電極的穩定性和重現性

H2O2濃度為10 mmol/L，PBS濃度為1/15 mol/L，將HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極在pH 6.98緩沖液中連續循環掃描10圈后，其電流響應信號仍能保持初始信號的90.6%，表明其重現性較好。而將此電極在PBS緩沖溶液中于4 ℃下冰箱中存放10 d，再次進行測定，其電流響應減小9.1%，表明修飾電極具有較好的穩定性。

2.5 實際樣品的檢測

分別取3份不同質量的市售醫用H2O2配成50 mL待測液，以HRP-CTS/C-MWNTs/GCE生物傳感器為工作電極，采用循環伏安法進行檢測，測得雙氧水的平均含量為2.93%。實驗結果與市售的醫用過氧化氫含量3%(標簽值)比較接近。表明HRP-CTS/C-MWNTs/GCE可用于實際樣品中H2O2含量的檢測。

3 結 論

研究了HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極的電催化性能，同時對催化機理進行了探討;用修飾電極測定PBS或H2O2溶液時均出現1對較為明顯的氧化還原峰，表明HRP-CTS/C-MWNTs/GCE生物傳感器很大地提高了催化效率。在pH 6.98，PBS緩沖溶液中HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極對H2O2具有良好的電催性能，并能準確、快速檢測市售醫用雙氧水的含量。

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Application of Chitosan-Carboxylic Multi-walled Carbon Nanotubes(HRP-CTS/C-MWNTs/GCE) Electrochemical Sensor in H2O2Detection

ZHANG Jun-li*，LI Rui-ling，PAN Qing-cai

(The College of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Huanghuai University，Zhumadian 463000，China)

The horseradish peroxidase(HRP) was fixed on the surface of glassy carbon electrode(GCE) modified by chitosan(CTS)-carboxylic multi-walled carbon nanotubes(MWNTs).The modified electrode thus prepared was named abbreviately as HRP-CTS/C-MWNTs/GCE.The HRP imbedded in the complex was characterized by fourier transform infrared spectrometry.The result indicated that its composition had no change.The electrochemical property of HRP-CTS/C-MWNTs/GCE was studied by cyclic voltammetry.It was found that the modified electrode exhibited an excellent electrocatalytic response toward the reduction of H2O2.In 1/15 mol·L-1PBS(pH 6.98) buffer solution， a pair of redox peaks were observed,and a good linear relationship(r=0.998 6) between values of reduction peak current and H2O2concentration was obtained in the range of 0.1-12 mmol·L-1.The method was applied in the detection of hydrogen peroxide the commercially available medical hydrogen peroxide，with content of 2.93%.

chitosan;carboxylic carbon nanotube;horseradish peroxidase;electrochemical sensor;hydrogen peroxide

2016-03-30；

2016-07-04

河南省科技發展計劃項目(132300410312);駐馬店市科技發展計劃項目(13604)；河南省教育科學規劃課題資助項目([2012]-JKGHAD-0249)；黃淮學院青年骨干教師資助計劃資助項目

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.024

O657.1；O625.524

A

1004-4957(2016)10-1351-04

*通訊作者：張軍麗，碩士，研究方向：殼聚糖及衍生物的合成及應用，Tel：0396-2853661，E-mail：zjl529@126.com