高效液相色譜-串聯質譜法同時測定供港生豬尿液中29種限用獸藥殘留

伍華雯，郭 平，張遠芳，曾 贊，萬建春，占春瑞

(1.江西出入境檢驗檢疫局 綜合技術中心，江西 南昌 330035；2.東北林業大學野生動物資源學院,黑龍江 哈爾濱 150040)

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高效液相色譜-串聯質譜法同時測定供港生豬尿液中29種限用獸藥殘留

伍華雯1*，郭 平1，張遠芳1，曾 贊2，萬建春1，占春瑞1

(1.江西出入境檢驗檢疫局 綜合技術中心，江西 南昌 330035；2.東北林業大學野生動物資源學院,黑龍江 哈爾濱 150040)

建立了高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)同時測定生豬尿液中喹諾酮類、磺胺類、磺胺增效劑、四環素類、林可胺類、大環內脂共29種限用獸藥殘留量的檢測方法。試樣經乙酸銨和EDTA-Na緩沖液提取，HLB固相萃取小柱凈化后，HPLC-MS/MS進行測定，其中β-受體激動劑類用內標法定量，其余獸藥用外標法定量。在電噴霧電離正離子模式下，以多反應監測(MRM)方式采集數據進行定性與定量分析。29種獸藥在豬尿基質中標準曲線的線性系數(r)均大于0.99，3個不同加標水平下的平均回收率為58%～108%，日內相對標準偏差(RSD)為1.9%～18.9%，日間RSD為3.4%～20.9%；定量下限(LOQ，S/N≥10)為1.0～10.0 μg/L。該方法經濟、高效、可靠，可用于生豬屠宰前獸藥多殘留的快速檢測。

高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)；生豬尿液；限用獸藥；多殘留

隨著贛港經貿的快速發展，江西對港出口呈連續增長趨勢，供港生豬尤為明顯，目前年供應量已居全國前列，香港市場約30%豬肉來自江西。香港對進口農副產品有嚴格質量要求，《食物內有害物質規例》中規定了生豬的46種獸藥限量標準，在一定程度上給江西供港生豬企業帶來障礙。目前，生豬體內獸藥殘留監控主要通過尿液檢測來實現，但我國豬尿中獸藥多殘留檢測標準嚴重缺乏，參考方法存在通量低的不足，難以滿足生豬供港快速通關要求。

目前采用液相色譜法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中獸藥殘留已有較多報道[1-5]。而在獸藥殘留檢測基質趨于多樣化的當下，豬尿中獸藥殘留的研究多為β-受體激動劑方面的檢測[6]。雖有同時測定多種獸藥殘留的方法報道[7-16]，但同時對豬尿中喹諾酮類、磺胺類、磺胺增效劑、林可胺類、大環內酯類5大類藥物殘留檢測技術的研究尚未見報道。本研究采用高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測生豬尿液中29種限用藥物的殘留量，以期實現生豬屠宰前獸藥多殘留的快速檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API4000+三重四極桿液相色譜-串聯質譜儀(美國AB Sciex公司)，配30A系列高效液相色譜儀(日本島津公司)；電子天平(德國Sartorius公司，感量0.01 g和0.1 mg)；旋渦混合器(德國IKA公司)；Eppendorf 5430R 冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)；N-EVAP 112氮吹濃縮儀(美國Organomatian Associates公司)；Visiperp DL固相萃取裝置(美國Supelco公司)；KQ-600B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SI G560E型旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)；pH計(美國Mettler Toledo公司)；Waters ACQUITY UPLC BEH RP C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm，美國Waters公司)。

生豬尿樣采自養殖場；陰性豬尿樣品采自養殖場中未給藥的生豬，經實驗室處理后上機測定，所得譜圖與標準溶液的譜圖進行比對加以確證。

甲醇、乙腈(HPLC純，德國Merck公司)；甲酸(HPLC 純，上海安普公司)；甲酸銨(HPLC 純，瑞士Sigma-Aldrich 公司)；無水乙酸銨(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；氨水、乙二胺四乙酸鈉(分析純，廣州西隴化工化學試劑有限公司)；HLB固相萃取小柱(500 mg，6 mL，美國Waters公司)；Milli-Q超純水(GB/T6682 規定的一級水)。

標準物質：29種獸藥標準物質的純度在93.0%～99.0%范圍內，均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。

標準溶液：1.0 g/L，取適量上述29種獸藥標準物質，分別用甲醇溶解配制成標準儲備溶液，-18 ℃保存于棕色玻璃瓶中。使用前以甲醇稀釋成合適濃度的標準工作液。

提取液：稱取15.4 g乙酸銨，加水溶解并定容至1 L，混勻，用乙酸調至pH 5.2，得到0.2 mol/L乙酸銨溶液；稱取37.2 g乙二胺四乙酸二鈉，加水溶解并定容至1 L，混勻后即得0.1 mol/L EDTA-2Na。

流動相：準確稱取0.315 3 g甲酸銨，加800 mL水溶解，準確加入1 mL甲酸，用水定容至1 L，搖勻，得到5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)。

溶解液：乙腈-流動相(2∶8，體積比)。

1.2 樣品預處理

1.2.1 樣品提取及凈化 準確移取(2±0.05) mL試樣，置于50 mL具塞聚丙烯離心管中，加6 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液(乙酸調至pH 5.2)和6 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，渦旋，4 500 r/min離心5 min。

上清液轉入HLB固相萃取柱(預先經5 mL甲醇、5 mL水活化)，依次用5 mL水、5 mL 0.5%的氨水、5 mL甲醇水(1∶9)淋洗小柱，真空抽干小柱，再依次用5 mL甲醇、5 mL濃氨水-甲醇(5∶95)洗脫，洗脫液于40 ℃下氮氣吹干，準確加入1 mL溶解液復溶，超聲，渦旋均勻，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀分析。

1.2.2 空白基質溶液的制備 準確移取(2±0.05) mL陰性豬尿試樣，按“1.2.1”操作步驟進行處理。

1.3 色譜-質譜條件

1.3.1 色譜條件 柱溫45 ℃;流速200 μL/min；進樣體積5 μL；流動相：A為5 mmol/L甲酸銨(含0.1%的甲酸)，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～2 min，20%B；2～3 min，線性遞增至24%B；3～5 min線性遞增至28%B；5～5.5 min，保持28%B；5.5～7 min，線性遞增至32%B；7～10.5 min，線性遞增至36%B；10.5～12 min，線性遞增至95%B；12～12.01 min，線性遞減至5%B；12.01～15 min，5%B。

1.3.2 質譜條件 ESI正離子模式掃描(ESI+)，多反應監測模式(MRM)，霧化氣壓力(GSI)：60 psi；輔助氣壓力：60 psi；氣簾氣壓力(CUR)：35 psi;離子源溫度：600 ℃；電噴霧壓力(IS)：5 500 V;單位分辨率掃描；碰撞氣體流速：中流速。

圖1 29種化合物混合標準溶液的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 29 analytes mixed standard solution

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜條件的優化

2.1.1 色譜條件的選擇 因待測的化合物種類較多，采用普通C18色譜柱分離所需時間較長，故本實驗采用超高效液相色譜柱Waters ACQUITY UPLCBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)進行分離。采用5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈作為流動相，通過調節流動相的洗脫梯度，各化合物的色譜峰分離良好，峰形尖銳。29種化合物的混合標準溶液色譜圖如圖1所示。

2.1.2 質譜條件的優化 去簇電壓(DP)和碰撞氣能量(CE)直接影響定性和定量離子的豐度，與方法的靈敏度密切相關[10]。本實驗對0.2 mg/L的各化合物標準溶液進行全掃描，結合各化合物的理化性質，在Q1MS(Q1)模式下確定母離子，Product Ion(MS2)模式選定2個豐度較高、干擾較少的子離子分別作為定性和定量離子，并依次對各化合物子離子的去簇電壓(DP)、碰撞氣能量(CE)、入口電壓(EP)及碰撞室出口電壓(CXP)進行優化。其中EP和CXP基本在10～12 V左右，其余參數結果見表1。

表1 29種獸藥的多反應監測(MRM)質譜相關參數

(續表1)

CompoundRetentiontimet/minQ1Massm/zQ3Massm/zDPU/VCEU/VMRMratio#/%SolventSwineurineTetracyline(四環素)58644514102?，1540100，10030，37211221Aureomycin(金霉素)64347904445?，4621100，10019，2362675Doxycycline(強力霉素)65444524281?，1539112，11226，434236Lincomycin(林可霉素)37340733592?，126097，9739，26106101Erythromycin(紅霉素)105271675586?，540765，9720，3018361708Tiamulin(硫粘菌素)105949451923?，1191106，5032，32344329

*：quantitative ion(定量離子)；#：average ratios of lincomycin and erythromycin at 1.0,2.0,4.0 μg/L and the other analytes at 10,20,40 μg/L(林可霉素和紅霉素在1.0，2.0，4.0 μg/L，其余化合物在10，20，40 μg/L加標水平下，其相應離子相對豐度比的平均值)

2.2 樣品前處理條件的優化

2.2.1 提取方法的優化 與單殘留方法相比，多殘留檢測的提取方法顯得頗為關鍵。喹諾酮類、磺胺類獸藥均呈現酸堿兩性，在酸性溶劑中更易被萃取；大環內酯類化合物在酸性條件下易開環，不穩定[13]，故提取液的酸度不宜過大；四環素族的化合物易與金屬離子發生螯合作用形成螯合物[14]。綜上原因，本方法采用乙酸銨和乙二胺四乙酸二鈉的緩沖液進行提取。

2.2.2 凈化條件的優化 相比動物組織肌肉、肝臟等基質，尿樣基質成分較簡單，因此本實驗主要結合待測化合物的理化性質進行凈化條件的優化。由于待測化合物種類較多，且各化合物的極性不同，故考慮選擇對酸性、堿性和中性化合物吸附范圍較廣的反相固相萃取小柱。在陰性試樣中分別添加不同濃度水平的29種化合物混合標準溶液，對比研究了HLB柱和PLS柱的凈化效果，發現兩者對大多數化合物的凈化效果無明顯差異，但HLB柱對高濃度添加水平的磺胺類、四環素等化合物的凈化效果略優，故確定選用HLB固相萃取柱進行實驗。

對淋洗液的種類進行了考察。由于尿樣基質中的雜質多為水溶性，先選用水淋洗，再選擇5%的甲醇水溶液淋洗，發現林可胺類等部分化合物存在明顯的雜質干擾。綜合考慮化合物的極性及酸堿特性，增加淋洗液中甲醇的比例后，樣液中仍存在雜質干擾。進一步增加氨水淋洗，并控制氨水的濃度以防待測物被淋洗下來。對不同濃度氨水溶液、不同比例甲醇水淋洗的對比研究顯示，相比僅用5%的甲醇水溶液，經0.5%氨水和10%甲醇水淋洗后，磺胺類和喹諾酮類化合物的回收率明顯提高，且對林可胺類化合物的除雜質效果明顯。

2.3 方法學驗證

2.3.1 定量下限與基質標準曲線 在陰性尿樣基質中添加一定濃度的標準溶液，在優化的色譜-質譜條件下進行測定，提取定量離子的色譜圖，根據色譜峰的信噪比不小于10(S/N≥10)確定29種獸藥的定量下限(LOQ)為1.0～10.0 μg/L。在選定的儀器條件下，測定6個濃度水平的系列混合標準工作溶液，以29種獸藥的質量濃度為橫坐標(x，μg/L)，峰面積為縱坐標(y)繪制標準工作曲線。結果表明，29種獸藥在1.0～200.0 μg/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r)為0.990 7～0.999 7(見表2)。

表2 29種獸藥在豬尿基質中的定量下限、回歸方程、相關系數(r)、回收率及相對標準偏差(n=6)

(續表2)

CompoundLOQ(μg/L)RegessionequationrSpiked(μg/L)Recovery(%)Intra?RSD(%)Inter?RSD(%)Difloxacin100y=13600x+292000995410，20，4093，98，10479，49，3369，63，36Sulfadiazine100y=9250x+83700994910，20，4070，77，9654，116，47182，123，146Sulfadimidine100y=3960x-84800997210，20，4083，72，91141，181，9947，156，104Sulfachloropyridazine100y=14500x-78900994410，20，4076，77，9586，135，43133，127，68Sulfathiazole100y=5340x+109000998310，20，4070，79，9597，157，66137，138，62Sulfamerazine100y=5320x-30600997910，20，4080，75，10079，170，53198，143，61Sulfamethoxypyridazine100y=14800x+7570994010，20，4069，74，9875，143，49195，147，49Sulfadoxine100y=43100x+1090000990710，20，4066，74，10062，179，79120，117，65Sulfamonomethoxine100y=11400x+60800998210，20，4082，78，10291，79，55209，109，51Sulfamethoxazole100y=9430x+118000994410，20，4073，80，9945，146，4072，70，63Sulfaquinoxaline100y=21700x+745000999710，20，4095，86，10679，54，38150，87，38Trimethoprem100y=932x+14600994410，20，4076，93，10568，33，68156，67，55Sulfisoxazole100y=12900x+141000997010，20，4067，72，9089，189，52198，125，103Oxytetracycline100y=3279x-91350994310，20，4095，67，7061，79，78195，203，182Tetracyline100y=4924x+21280994410，20，4067，83，8966，39，118175，108，105Aureomycin100y=1353x-35820998610，20，4080，65，58173，53，100153，34，121Doxycycline100y=9153x+22940998910，20，4078，94，10035，115，172179，149，179Lincomycin10y=51800x+531000995010，20，4099，98，10888，90，19103，96，70Erythromycin10y=13400x+65700997210，20，4095，96，91127，74，102145，78，135Tiamulin100y=8240x+1020000997410，20，4095，102，10892，32，2198，44，135

2.3.2 回收率與精密度 取陰性豬尿樣液做低、中、高3個濃度水平的加標回收實驗，每個水平做6個平行測定，重復3次，分別計算同一次實驗同一濃度水平6個平行之間(日內)和3次重復試驗之間(日間)的相對標準偏差(RSD)，結果見表2。各化合物的平均回收率為58%～108%，日內RSD為1.9%～18.9%，日間RSD為3.4%～20.9%。表明該方法的回收率和重現性均較好。

2.3.3 確證分析 根據相同實驗條件下，檢出物質色譜峰的保留時間應與標準品一致(允許偏差為±2.5%)，且扣除背景后樣品譜圖中各定性離子的相對豐度比與濃度接近的標準溶液譜圖相比，允許偏差符合歐盟導則EC Decision 625/2002中的規定[17]，可判定樣品中存在對應的被測物。本實驗計算了3個加標水平(林可霉素和紅霉素添加1.0，2.0，4.0 μg/L，其余27種添加10，20，40 μg/L)下29種化合物在純溶劑和豬尿基質中定性離子的相對豐度比，結果表明，29種化合物在豬尿基質中3個加標濃度水平的平均離子相對豐度比與純溶劑中離子相對豐度比基本相當，均在歐盟導則所允許的范圍內，詳見表1。

2.4 實際樣品的測定

使用該方法測定江西省供港生豬尿樣共884批次，以四環素類和磺胺類藥物的檢出率較高，其中有437批次尿樣中的四環素類藥物殘留超出方法定量下限，37批次尿樣中的四環素類獸藥超出《食物內有害物質規例》中的最大殘留限量。

3 結 論

本文以供港生豬尿液為樣本，采用乙酸銨和EDTA緩沖液體系酶解提取，HLB固相萃取柱凈化，利用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱進行分離，建立了高效液相色譜-串聯質譜同時測定生豬尿液中29種獸藥殘留的分析方法。該方法的定量下限滿足《食物內有害物質規例》對生豬中46種獸藥限量的規定，各項技術指標均能滿足日常殘留檢測分析的要求，能有效為施檢單位縮短檢測時間、降低檢測成本；同時也能為養殖戶縮短生豬通關時間,從而節約存欄成本。

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Simultaneous Determination of 29 Restricted Veterinary Drug Residues in Urine of Swine Supplied to Hong Kong by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WU Hua-wen1*，GUO Ping1，ZHANG Yuan-fang1，ZENG Zan2，WAN Jian-chun1，ZHAN Chun-rui1

(1.Comprehensive Technology Center,Jiangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanchang 330035,China；2.College of Wildlife Resoureces,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

A new approach was established for the simultaneous determination of 29 restricted drugs,including quinolones,sulfoamides,trimethoprim,tetracyclines,lincosamides,macrolides in urine of swine supplied to Hong Kong by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The analytes were extracted with ammonium acetate and EDTA buffer,and followed by cleanup using an HLB solid phase extraction cartridge.The sample matrix-matched calibration was used to determine the residue.Electrospray ionization mass spectrometry was operated in the positive mode. The analysis of 29 restricted drugs was achieved under the multiple reaction monitoring(MRM) mode.The results indicated that correlation coefficients of the calibration curves were more than 0.99.The average recoveries of 29 analytes at three spiked concentration levels ranged from 58% to 108%.The intra-day relative standard deviations(RSDs) were in the range of 1.9%-18.9%,and the inter-day RSDs were 3.4%-20.9%.The limits of quantitations(LOQs,S/N≥10) were in the range of 1.0-10.0 μg/L.The method is economic,high efficient and reliable,and is suitable for the simultaneous determination of multiple residues of veterinary drugs in swine urine．

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);swine urine;restricted drug;multiple residues

2016-04-01；

2016-05-04

江西省科技計劃項目(20151BBF60038)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.007

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)10-1261-06

*通訊作者：伍華雯，助理工程師，研究方向：食品安全與檢測分析，Tel:0791-86358771，E-mail:dcwhw@163.com