核磁共振技術結合化學計量學方法用于蜂蜜的摻假鑒別

劉 蕓，丁 濤*，吳 斌，張 睿，沈崇鈺，費曉慶，張闊海，劉建紅，鄧曉軍，郭德華

(1.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210001；2.北京同仁堂蜂業有限公司，北京 102400；3.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200000)

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核磁共振技術結合化學計量學方法用于蜂蜜的摻假鑒別

劉 蕓1，丁 濤1*，吳 斌1，張 睿1，沈崇鈺1，費曉慶1，張闊海2，劉建紅2，鄧曉軍3，郭德華3

(1.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210001；2.北京同仁堂蜂業有限公司，北京 102400；3.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200000)

采用核磁共振技術(NMR)結合化學計量學分析手段研究了真蜂蜜和摻假蜂蜜的指紋圖譜變化情況。采用無監督的主成分分析(PCA)和有監督的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等多元統計分析方法從核磁信號中提取各組的分類信息。結果表明：建立的OPLS-DA模型能夠區分真假蜂蜜，所建模型對蜂蜜真假判別的解釋能力為90.5%，對未知樣本的預測能力為75.5%、識別率為89.7%。置換測試驗證表明，化學計量學模型具有很好的穩定性和預測性，可信賴性強，且模型穩健。通過OPLS-DA模型的載荷圖和相關系數分析找到了對區分摻假蜂蜜有顯著作用的標志物。結合相關系數分析，建立了辨別真假蜂蜜的多元線性回歸方程。該方法可簡單、快速地用于未知蜂蜜的摻假鑒別，為規范蜂蜜市場提供有利的依據。

核磁共振技術；化學計量學方法；模式識別技術；蜂蜜摻假

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結合后，經充分釀造而成的天然甜味物質，是一種營養豐富的天然滋養食物[1]。其主要成分為糖類，其中60%～80%是人體易吸收的葡萄糖和果糖。此外，還含有與人體血清濃度相近的多種無機鹽、維生素、有機酸及有益人體健康的微量元素和多種氨基酸，并含有生物活性很強的蔗糖轉化酶和淀粉酶等[2]，具有極高的保健作用和營養價值，深受消費者的喜愛。我國蜂蜜國家標準規定，不得在蜂蜜中添加或混入任何淀粉類、糖類或代糖類物質[3]。近年來，國內和國際市場對蜂蜜的需求量不斷增加，然而蜂蜜的產量難以滿足市場需求[4-6]。在巨大經濟利益的驅使下，不法分子在高品質蜂蜜中加入其它低品質的蜂蜜以次充好，或者在蜂蜜中摻入果葡糖漿等甜味物質以假亂真，影響了蜂蜜產品的市場秩序和我國蜂蜜產品的出口貿易。蜂蜜檢測技術遇到了很大的挑戰。

如何鑒別蜂蜜的摻假問題，成為人們普遍關心的問題。目前，國家制定了相關標準對蜂蜜摻假進行有效判斷，以保障消費者合法權益。薄層色譜(TLC)是測定高果淀粉糖漿的有效方法[7]。通過高效液相色譜示差折光法測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的含量，可以判斷蜂蜜中糖是否符合國家標準[8]，該法可檢測蜂蜜中摻雜的麥芽糖漿，而對于摻雜果葡糖漿的蜂蜜，該方法無效。碳同位素質譜法可以有效鑒定天然蜂蜜產品中是否摻入碳4 植物的糖漿[9-10]，但該方法只能用于證明摻雜物超過7%的蜂蜜，而對于蜂蜜摻入利用水稻、小麥、大豆等碳3 植物淀粉制備的糖漿則無法辨別其真偽[11]。目前這些現有的國家標準對蜂蜜摻假檢測的主要原理是對蜂蜜中某一種或某一類物質進行分析。但造假者若根據國家標準的技術指標要求進行調配，摻入后各項理化檢測指標可完全符合國家標準，這樣很難和真正的蜂蜜進行區分。已有的檢測方法多針對已有的摻假造假技術而開發，必然落后于造假摻假技術的發展。現有檢測手段自身的不足和缺陷給不法分子提供了蜂蜜摻假的可乘之機。綜上所述，開發出多指標多組分鑒別蜂蜜真偽的方法迫在眉睫。

核磁共振技術(NMR)能夠無損地檢測含量在檢出限內的所有小分子化合物，在特定的條件下對樣品中所含各化合物的檢測靈敏度相同[12]，是一種無偏向性分析手段。核磁共振技術結合化學計量學分析方法已運用于蜂蜜和其它食品分析[13]。Boffo等[14]通過1H NMR技術結合化學計量學方法區分了巴西蜂蜜的原產地，且明確了對分類起關鍵作用的核磁信號。野生蜂蜜含有高濃度的苯丙氨酸和酪氨酸，摻假的蜂蜜核磁譜中有5-HMF、檸檬酸和乙醇的信號。該研究分別選用近鄰分類算法(KNN)和有監督的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)算法建立蜂蜜的分類模型，對蜂蜜分類的正確率分別為66.7%和72.2%。Ribeiro等[15]運用LF-1H NMR建立了80個蜂蜜樣品的物理化學參數與弛豫時間的關系，弛豫時間T1和T2分別在0.6～1.8 ms和2.3～5.4 ms之間。結果表明，弛豫時間可用來區分不同類型的蜂蜜。Ribeiro等[16]運用LF-1H NMR建立了蜂蜜中摻入高果淀粉糖漿的鑒定方法，所有樣品的橫向弛豫時間和縱向弛豫時間分別在1.26～1.60 ms和3.33～7.38 ms范圍內，且在摻假蜂蜜中，隨著高果淀粉糖漿含量的增加，弛豫時間也增加。Simova等[17]基于NMR技術建立了快速區分橡樹蜂蜜與其它蜂蜜的方法，結合氫譜和碳譜的信息，確定了槲皮醇的結構，所有的橡樹蜂蜜都含有該標志物，而其它類型的蜂蜜則不存在。Sandusky等[18]運用選擇性的TOCSY方法測定蜂蜜中微量的氨基酸，結合多維數據統計分析方法能夠區分不同產地的蜂蜜，與傳統分析方法相比，更為靈敏、快速，能夠明確化合物的結構。由于蜂蜜具有成分復雜，且不同地域蜂蜜的內部組分含量變化范圍大等特點，以上所建立的方法對我國蜂蜜是否適用還不得而知，而且目前國內尚無運用NMR技術結合化學計量學方法判斷蜂蜜真偽的方法報道。本研究采用核磁共振技術對蜂蜜中多組分進行分析，結合化學計量學方法，以期能夠從獲得的多核磁信號中提取出對摻假蜂蜜有顯著性影響的標記物，從而為蜂蜜真偽判別提供切實可行的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Advance 400 M型核磁共振儀(瑞士布魯克公司)，5 mm雙核z-梯度探頭及Topspin 2.3 試驗控制及數據處理軟件；5 mm核磁共振樣品管(美國Norell公司)；高速離心機(德國Sigma公司)；XW-80A型渦旋混合器(上海醫科大學儀器廠)；LP403分析天平(德國賽多利斯公司)。

溶劑：重水(D2O，氘帶度為99.8% ，Cambrideg Isotope Laboratories公司)；3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸鈉(純度大于99.9%)、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉(優級純)購于Aldich-Sigma公司；NaN3(分析純，天津福晨化學試劑廠)。

1.2 蜂蜜樣品信息

61個蜂蜜樣品包括：楊槐蜜、油菜蜜、椴樹蜜、荊條蜜、紫云英蜜、荔枝蜜、龍眼蜜、棗花蜜、枸杞蜜、葵花蜜、黃芪蜜、益母草蜜、枇杷蜜、黨參蜜、小茴香蜜和雜花蜜；蜂蜜的加工工藝包括脫水、脫色、脫抗生素；蜂蜜的產地包括：江蘇、河南、新疆、四川、內蒙、湖北、遼寧、吉林、陜西、山東、甘肅；所有的蜂蜜樣品經實驗室摻假檢測后指標均合格。糖漿樣品包括甜菜糖漿、大米糖漿、木薯糖漿、小麥糖漿、果葡糖漿或其混合糖漿，其加工工藝及儲存時間有詳細記錄；摻假蜂蜜樣品主要來自市場上銷售的經實驗室摻假指標檢驗合格樣品、糖漿樣品和蜂蜜樣品的任意比例混合；糖漿及摻假蜂蜜樣本總數共82個。

1.3 樣品制備

對無結晶的蜂蜜樣品，將其攪拌均勻。對有結晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過60 ℃的水浴中溫熱，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫，分出0.5 kg作為試樣。將制備好的試樣置于樣品瓶中，密封，并標明標記，于室溫下保存。

1.4 樣品前處理及數據采集過程

蜂蜜樣品經0.10～0.14 mm孔徑尼龍濾布過濾除去蜂蜜中的固體雜質后，準確稱取0.25 g樣品于離心管中，加入1 mL 重水，溶解完全；加入200 μL濃度為1.5 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 4.0)和100 μL含體積分數為0.05%的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸鈉內標溶液，渦旋振蕩3 min至均勻混合，離心10 min，取上清液于核磁管中。每個樣品制備2份以供測定分析。

所有真蜂蜜和摻假蜂蜜樣品按隨機順序進樣分析以避免在分析過程中可能產生的儀器誤差。為了抑制蜂蜜中水的共振信號，所有蜂蜜樣本的1H NMR分析均采用noesypr1d脈沖序列。在400 MHz核磁共振波譜儀上進行1H NMR測試，實驗溫度為298 K，利用D2O進行鎖場，采用預飽和方法壓制水峰；其中在Topspin軟件中各參數設置如下：PULPROG=noesypr1 d,AQ_mod=DQD,TD=32 K,NS=8*N,DS=4,TD0=1,SW=6 000 Hz,D1=3 s,DE=4 μs,D8=0.1 s,信號累加240次。

1.5 數據處理

對得到的一維1H NMR譜圖進行基線校正和相位校正。基線校正選擇polynomial fit擬合方式，相校正選擇global和metabonomics算法先自動優化，后針對特定區域進行手動校正，使盡可能多的積分值為正值。為消除殘留水信號和內標物信號對分析結果的影響，其中，蜂蜜1H NMR譜參照3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸鈉定標，化學位移定為δ= 0.000 ppm，將1H NMR譜中化學位移在δH4.69 ～ 5.20 區間的數據和內標物信號在δH0.00 ～0.10之間的數據從數據矩陣中剔除。按每段寬度δ為0.02 ppm進行分段積分，共得到470段積分數據。積分后的核磁數據峰面積在不同組分之間和不同樣品之間的差異較大。為了減小這些差異的影響，按每張核磁譜的總積分強度進行歸一化處理，原始數據經數據歸一化處理后，各積分處于同一數量級，適合進行綜合對比評價，所得積分數據輸出并轉換為Excel文件保存。在數據集中，行代表某一化學位移區間的峰面積，列為樣本的種類。將數據輸入SIMCA-P 12.0 軟件(Umetrics AB，Ume?，Sweden)進行多維統計分析。

2 結果與討論

圖1 正常蜂蜜(A)、摻假蜂蜜(B)和大米糖漿(C)的1H NMR譜(D2O,400 MHz)Fig.1 Representative 400 MHz 1H NMR spectra from pure honey(A)，adulterated honey(B) and rice syrup sample(C)

2.11H NMR代謝指紋圖譜

利用Topspin 2.3軟件對樣品的核磁共振信號進行傅立葉變換，得出蜂蜜樣品、摻假蜂蜜和糖漿樣品典型的1H NMR指紋圖譜(如圖1)。由圖1可見，通過典型的指紋圖譜很難直觀地看出純天然蜂蜜和摻假蜂蜜之間的顯著性差異譜峰，因此，必須對所有數據進行化學計量學分析，以從細微的差別中提取出對天然蜂蜜和摻假蜂蜜顯著的生物標志物。

首先對方法學進行考察，以確保結果的準確性和可靠性。日內精密度考察結果顯示，選取響應值較大的前5個峰積分，其峰面積和對應化學位移的相對標準偏差(RSD，n= 6)分別為0.39%～2.12%和0.25%～0.80%。基于NMR方法的蜂蜜樣品的穩定性結果表明，實驗過程中，蜂蜜在4 ℃冰箱條件下存儲5 d，共有峰的峰面積和化學位移的RSD(n= 6)分別為(4.25 ± 0.98)% 和(1.34 ± 0.67)%，表明在該核磁條件下，建立的指紋分析方法準確、可靠。

2.2 多元統計分析

2.2.1 觀察變量的選擇 在選擇觀察變量時，強烈界外的觀察變量由Hotelling'sT2Range算法得到。對于多維正常分布，所有樣本的T2值形成Hotelling'sT2Range圖。當T2超過臨界值時(0.01作為置信區間)，該觀察變量被認為是強烈的界外值，應預以剔除(如圖2)。因此真蜂蜜組中剔除5個樣本，假蜂蜜組中剔除7個樣本，其余所有樣本用于下一步的模型建立。

2.2.2 主成分分析與偏最小二乘判別分析 從核磁指紋圖譜可見真蜂蜜、摻假蜂蜜及糖漿核磁信號的差異。然而僅從單一幾個信號的改變很難全面揭示摻假蜂蜜和真蜂蜜的差異。首先采用非監督的主成分分析(PCA)方法對兩組蜂蜜樣品進行分類，從PCA得分圖(圖3A)可以看到摻假蜂蜜和真蜂蜜樣品有明顯的分離趨勢，但存在過重合的現象，可能是摻假蜂蜜含有真蜂蜜的成分，與真蜂蜜的性質有相似之處。而且，在樣品收集過程中，蜂蜜的蜜種、產地、成熟度等因素會影響分類的準確性。為避免不必要的變量給樣品分類帶來較大的誤差和分析樣本間個體差異的影響，進一步采用有監督的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)方法用于分類(如圖3B)，較PCA模型，PLS-DA模型中真假蜂蜜有了明顯的分離。為了提高分類和判別的準確性，常采用正交信號濾噪技術(OSC)與PLS相結合，以除掉分類信息中包含的不相干影響因素，找到個體間更加細微的差異。因此，本研究又建立了正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型(如圖3C)，可觀察到兩組樣品分散在得分圖中的不同區域，獲得了更好的分類結果。

圖3 真假蜂蜜的模型得分圖

ModelParameterParCtrUVPCANoA444R2X(cum)083105880789Q2(cum)-0212-02980423Rra/%853816897PLS-DANoA656R2X(cum)062205010522R2Y(cum)081207670850Q2(cum)079806270709Rra/%828823758OPLS-DANoA755R2X(cum)068207890569R2Y(cum)090507970769Q2(cum)075507410785Rra/%897821856

aRr is the abbreviation of the reorganization rate(Rr為識別率的縮寫)；No.A denotes number of principle components calculated by cross validation(No.A為置換測試得到的主成分個數)

圖4 OPLS-DA模型前兩個主成分置換200次對應的模型驗證圖Fig.4 Corresponding validate model plot from the OPLS-DA models based on 200 permutations test for the first two components

多元統計分析時需優化數據預處理方法，以確保所建立模型為最佳模型。常見的標度化方法有中值標度化(Mean-centred，Ctr)、自標度化(Autoscaled，UV)和Parto variance(Par) 3種。Ctr更加注重分析數據波動部分，缺點是可能導致低含量的變量信息受到高含量信號的抑制[19]；UV可以消除由于含量差異導致的數據掩蓋，缺點是小峰的測量誤差被同步放大[20]；Par能夠削減較大數據的相對重要性，保持數據集的部分完整性，缺點是造成變化相對較小的重要組分不能被選為標記物[21]。3種方法各有優缺點，實際分析中需要依據具體數據進行篩選。在SIMCA-P中評價模型質量的參數有R2X，R2Y和Q2Y，其中R2X和R2Y分別表示模型對X和Y矩陣的解釋能力，Q2Y表示模型的預測能力，R2和Q2越接近1則說明模型越穩定可靠，一般情況下該值高于0.5即說明模型較好。

依據3個標度化方法，對真假蜂蜜的核磁信息建立3個數學模型(PCA，PLS-DA和OPLS-DA)，具體的模型參數如表1所示。由此可見，Par作為標度化方法所建模型的R2Y和Q2均較高，因此選擇Par作為建模前數據預處理的方法，選擇OPLS-DA作為真假蜂蜜分類的化學計量學模型，所建模型對蜂蜜真假判別的解釋能力為90.5%，對未知樣本的預測能力為75.5%,識別率為89.7%。

2.2.3 模型有效性確定 為避免模型獲得分類的偶然性，采用置換測試(Permutation test)法對所建模型進行驗證。保持X變量不變，通過隨機置換Y變量的順序，觀察多個Y變量的順序隨機排列的模型與原始Y變量模型之間的差異。排列置換后，以得到的對Y變量順序隨機排列模型的R2值、Q2值與原始模型的R2值、Q2值之間作回歸曲線，以作為衡量模型是否過擬合的標準。通常要求最右端原始鑒別模型的Q2值大于左邊任何一個Y變量隨機排列模型的Q2值。前兩個主成分置換200次對應的模型驗證圖如圖4所示。結果表明，建立的OPLS-DA模型的R2和Q2分別為0.670和-0.778 9，表明模型具有很好的穩定性和預測性，且可信賴性強，模型穩健。

2.2.4 標記物的發現 基于建立的OPLS-DA模型，采用模型的載荷圖來篩選區分真假蜂蜜潛在的生物標記物。對不同組的樣本分類貢獻較大的代謝物質通常是在載荷圖中遠離中心原點的物質，即離中心的距離越遠，對分類的影響越大。如圖5A所示，離中心距離遠的變量可能代表著潛在的生物標記物。同時結合相關系數分析(圖5B)，可更直觀地反映出各變量對分類貢獻的大小，以相關系數絕對值大于0.05為選擇依據。最終依次選取P130,P152,P297,P319,P357和P363對應的核磁分段位移作為對真假蜂蜜分類影響最大的變量。這些變量可作為潛在的標記物，然而目前對其結構的解析存在困難，后續將針對這些標記物開展結構鑒定研究。

通過相關系數分析，得到各變量的因子相關性系數值。類別變量Y代表樣品的類型，將純蜂蜜樣品數值設定為“1”，將糖漿和摻假蜂蜜樣品的類型變量數值設為“0”，閾值設為0.5。據此，得到辨別真假蜂蜜判別函數的線性回歸方程為:Y=-0.062 90X1-0.074 38X2+0.089 85X3-0.091 60X4-0.078 96X5+0.078 28X6+0.859 5，式中Y表示真蜂蜜或假蜂蜜，X1,X2,X3,X4,X5和X6分別表示第130,152,297,319,357和363個分段積分的峰面積。對于未知樣品，分別提取上述6個核磁分段積分的峰面積，代入線性回歸方程，若Y值接近1±0.5，則判別為真蜂蜜，若Y值接近0±0.5，則判別為假蜂蜜。

3 結 論

本文建立了核磁共振技術結合化學計量學模型鑒別蜂蜜真假的方法。針對現行的蜂蜜質量檢測方法只關注一種或幾種成分的含量和變化，該方法首先建立了純蜂蜜和摻假蜂蜜的OPLS-DA模型，由置換測試方法對模型進行可靠性驗證，避免發生過擬合現象。OPLS-DA模型的載荷圖和相關系數分析用于蜂蜜摻假標志物的篩查，并找到了相應的核磁分段位移作為對真假蜂蜜分類影響最大的變量。基于找到的摻假標志物，建立了辨別真假蜂蜜的多元線性回歸方程。該方法可簡單、快速地對未知蜂蜜進行摻假鑒別，具有分析時間短、完整性強、專屬性好、可控性強、準確性高等優點，可以彌補目前蜂蜜摻假鑒別方法存在的缺陷。本研究的實施對推動行業科技進步、規范蜂產品市場、保障消費者合法權益以及促進我國蜂產品事業的健康發展具有重要意義。

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Identification of Honey Adulteration by Nuclear Magnetic Resonance Technology and Chemometrics Method

LIU Yun1，DING Tao1*，WU Bin1，ZHANG Rui1,SHEN Chong-yu1,FEI Xiao-qing1，ZHANG Kuo-hai2，LIU Jian-hong2，DENG Xiao-jun3，GUO De-hua3

(1.Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing 210001,China；2.Beijing Tongrentang Bee Industry Co.,Ltd.,Beijing 102400,China；3.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai 200000,China)

Currently existing national standards for honey adulteration are based on one type or certain types of compounds.Therefore,it is necessary to develop a multi-component and multi-index method to identify the honey adulteration.In this research,the changes of fingerprint between pure and adulterated honey were explored based on the NMR fingerprinting analysis and chemometrics method.Unsupervised method of principal component analysis(PCA),supervised method of partial least squares discriminant analysis(PLS-DA) and orthogonal-PLS-DA(OPLS-DA) were all used to extract the useful information from NMR signals.The results showed that OPLS-DA model could distinguish the adulterated honey from pure honey.The explanation abilities based on the OPLS-DA model was 90.5%.The prediction and recognition abilities were 75.5% and 89.7%，respectively.Through permutation test,the chemometric model showed good stability,accurate predictability and high reliability.Several significant markers were found to distinguish honey from the loading plot and correlation coefficient analysis of OPLS-DA model.Combined with the correlation coefficient analysis,multiple linear regression equation was established to distinguish the adulterated honey from pure honey.The proposed method was simple and sensitive.This method provided an effective approach to control the honey quality and detect the honey adulteration.

nuclear magnetic resonance technology(NMR)；chemometrics method；pattern recognition technology；honey adulteration

2016-03-09；

2016-05-21

江蘇出入境檢驗檢疫局科技計劃(2015KJ29，2016KJ05)；上海長三角科技合作項目(15395810100)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.005

O482.532；S896.1

A

1004-4957(2016)10-1248-07

*通訊作者：丁 濤，碩士，高級工程師，研究方向：食品安全分析與質量控制，Tel:025-52345183，E-mail：dingt@jsciq.gov.cn