漢坦病毒Hunan03株S基因克隆、表達及核蛋白免疫原性分析

蔡 亮，張 紅，高立冬，劉建高, 覃 迪，何方玲，劉佳惠，鄒義洲，李俊華

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漢坦病毒Hunan03株S基因克隆、表達及核蛋白免疫原性分析

蔡 亮1,2，張 紅1，高立冬1，劉建高1, 覃 迪1，何方玲1，劉佳惠1，鄒義洲2，李俊華1

目的 構建漢坦病毒Hunan03株核蛋白基因原核重組表達載體，在大腸桿菌中進行核蛋白表達，研究核蛋白的免疫性及免疫反應性。方法 設計特異性擴增漢坦病毒Hunan03株S基因完整開放閱讀框(ORF)的引物，RT-PCR擴增，產物克隆到pGM-T載體，轉化感受態細胞TOP10，應用藍白斑篩選、酶切、PCR鑒定，定向克隆到pGEX-6p-2原核表達載體，轉化Ecoli.BL21 StarTM(DE3)，IPTG誘導表達，SDS-PAGE、Western blot對重組蛋白進行鑒定。應用Glutathione Sepharose 4B純化柱純化重組蛋白，免疫新西蘭兔，建立間接ELISA法對核蛋白的免疫原性與免疫反應性進行評價。結果 PCR擴增S基因ORF區域產物大小約1 306 bp，重組載體pGEX-6p-2-S經雙酶切、PCR、測序鑒定提示構建成功；在37 ℃，IPTG濃度為0.8 mmol/L誘導5 h的條件下，表達出最高量的相對分子量約74 kDa的GST-NP融合蛋白。建立的間接ELISA法檢測GST-NP融合蛋白免疫后的新西蘭兔血清，IgM抗體滴度達1∶8 000，IgG抗體滴度達1∶16 000。結論 成功構建了高效表達的漢坦病毒S基因重組表達載體，獲得了純度較高具有較好的免疫原性與免疫反應性的核蛋白，為后續漢坦病毒單克隆抗體的制備奠定了基礎。

漢坦病毒；S基因；原核表達；核蛋白免疫原性

漢坦病毒(Hantavirus, HV) 為分節段的單股負鏈RNA病毒，人和嚙齒類動物均可被感染，其L、M、S基因分別編碼依賴RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(G1、G2)及核衣殼蛋白(NP)[1]。NP又稱核蛋白，由S基因編碼，是病毒的主要結構蛋白，免疫原性極強，刺激機體可引起強烈的體液免疫和細胞免疫應答，產生的抗體滴度高、維持時間長，在抗病毒免疫中起重要作用，不同株、型的病毒NP氨基酸序列保守，常用作為HV感染后的診斷蛋白[2,3]。在前期研究中我們從黑線姬鼠肺組織中分離到了漢坦病毒Hunan03株(GenBank No. JN712306)[4]，對S基因分子特征及核蛋白二級結構進行了預測和分析[5,8]，在此基礎上我們將S基因的ORF區域克隆到pGEX-6p-2原核表達載體，在大腸桿菌中進行了表達，利用動物實驗對核蛋白的免疫原性與免疫反應性進行了初步研究，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株與試劑 質粒pGEX-6P-2(GE Healthcare, USA)，Glutathione Sepharose 4B蛋白純化柱(GE Healthcare, USA)，抗GST McAb(Cell Signaling Technology Inc，USA)，Ecoli.BL21 StarTM(DE3)、JM109(TIANGEN,北京)，Trizol、One-step RT-PCR System with Platinum○RTaq High Fidelity、Platinum○RPCR Super Mix、TOPO○R TA Cloning○R Kit(Invitrogen,USA)、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ、XhoⅠ限制性內切酶、1 000 bp DNA Marker、低分子量蛋白Marker(Fermentas,Canada)，膠回收試劑盒、小量質粒提取試劑盒(Axygen,USA)。

1.2 引物設計與合成 根據前期研究上傳至GenBank的漢坦病毒Hunan03株(GenBank No. JN712306)S基因編碼區序列及質粒pGEX-6P-2多克隆位點，應用Primer Premier 6.0設計一對擴增S基因編碼區全長的特異性引物，為了便于克隆與表達，在引物兩端引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點及保護性堿基。上游引物pGEX-6P-2-F：5′-TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG- 3′(5′端下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)；下游引物pGEX-6P-2-R : 5′-CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC- 3′(5′端下劃線部分為XholⅠ酶切位點)，委托Invitrogen公司合成。

1.3 RNA提取、cDNA合成及PCR產物純化回收 Trizol 法提取HV鼠肺組織Hunan03株陽性標本總RNA，在引物pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R作用下，應用One-step RT-PCR System with Platinum○RTaq High Fidelity試劑盒對S基因ORF區域進行一步法逆轉錄及擴增。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，應用Axygen膠回收試劑盒對產物進行純化回收。

1.4 TA克隆與鑒定 PCR產物純化回收后，參照TOPO○RTA Cloning Kit說明書按照PCR產物與T載體1∶5的比例于22 ℃進行連接反應，取10 μL連接產物轉化Ecoli. TOP10，挑選陽性克隆抽提質粒，應用Platinum○RPCR Super Mix試劑盒進行 PCR鑒定，應用EcoRⅠ、XhoⅠ于37 ℃進行雙酶切鑒定。

1.5 重組質粒pGEX-6P-2/S的構建與鑒定 鑒定后的TA克隆陽性質粒與pGEX-6P-2空質粒在37 ℃條件下同時進行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切、電泳、目的片段回收純化。在1∶3比例下應用T4 DNA連接酶于22 ℃連接反應10 min，取連接產物10 μL轉化感受態細胞TOP10，涂布100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37 ℃倒置培養過夜。挑選單克隆菌落，抽提質粒，取1 μL進行PCR鑒定。應用EcoRⅠ、XholⅠ對重組質粒進行雙酶切，PCR產物及酶切產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，對pGEX-6P-2/S重組質粒送Invitrogen公司進行序列測定。

1.6 S基因的表達 將pGEX-6P-2/S重組質粒轉化工程菌Ecoli.BL21 StarTM(DE3)感受態細胞，37 ℃培養24 h，挑單克隆菌落于含100 ug/mL氨芐青霉素的LB培養液中(2 mL)培養至OD值為0.6左右，加入不同濃度IPTG(0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L)，37 ℃水浴誘導培養3～8 h，離心收集菌體。

1.7 包涵體的溶解與復性 收集的菌體經冰浴超聲裂解，應用洗液Ⅰ(60 mmol/L EDTA，4% Triton X-100，1.5 mol/L NaCl，pH7.0)，洗液Ⅱ(0.1 mol/L Tris-Cl，20 mmol/L EDTA，2 mol/L Urea，pH7.0)洗滌，收集上清和包涵體，12%SDS-PAGE電泳。包涵體應用溶解液(8 mol/L Urea，20 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，6 mmol/L DTT，pH8.0)溶解過夜后裝入含GST融合蛋白復性液(20 mmol/L Tris-Cl pH8.0，1 mmol/L EDTA pH8.0，0.9 mmol/L GSH，0.1 mmol/L GSSG)的透析袋中復性24 h。

1.8 GST-NP重組蛋白純化、Western blot 將10 mL Glutathione Sepharose 4B 加入GST蛋白純化柱，PBS洗滌至柱平衡，以0.1 mL/ min流速加入10 mL 的復性蛋白，使蛋白充分吸附，PBS 洗滌層析柱至重新平衡，超純水洗脫目的蛋白，具體操作參考GST蛋白純化柱說明進行。洗脫的GST-NP融合蛋白經12% SDS-PAGE 電泳分離，電轉移至PVDF膜，以抗GST McAb為一抗、HRP標記的羊抗鼠抗體為二抗, ECL顯影，Western blot鑒定。

1.9 GST-NP重組蛋白濃度測定 在核酸蛋白分析儀上，采用A280紫外分光光度法，應用BSA蛋白濃度標準品繪制標準曲線，測定純化后GST-NP濃度。

1.10 動物實驗制備抗GST-NP重組蛋白特異性抗體 以鑒定的重組蛋白GST-NP為免疫原免疫新西蘭兔(雄性，6只，2.5～3.0 kg/只)，初次免疫用純化蛋白200 μg與等體積弗氏完全佐劑注射器攪拌混勻，皮內多點注射，15 d后每隔10 d用純化蛋白100 μg與等體積弗氏不完全佐劑混勻，加強免疫3次；同時用純化蛋白的洗滌液和GST蛋白各免疫2只新西蘭兔作對照；每次免疫前于耳緣靜脈采血，末次免疫10 d后心臟采血，離心分離血清，保存于-20 ℃。

1.11 免疫血清抗GST-NP重組蛋白抗體滴度測定 用0.05 mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋純化的GST-NP重組蛋白至1 mg/L，按每孔100 μL包被酶標板過夜，間接ELISA法檢測PBS系列稀釋的末次兔免疫血清，二抗為羊抗兔IgG-HRP和IgM-HRP 100 μL(1∶1 000稀釋)，TMB顯色，酶標儀測定A450值，以對照組兔血清作陰性對照，待測樣本A450值/陰性對照A450值≥2.1(P/N值≥2.1)為陽性，陽性最高抗體稀釋度為血清效價。

2 結 果

2.1 S基因的PCR擴增及TA克隆鑒定 Trizol提取后的RNA經pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R引物進行一步法RT-PCR擴增S基因，1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增條帶約1 306 bp，與預期大小一致，提示擴增的DNA為目的片段。以抽提后的TA克隆質粒為模板，用pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R引物對S基因進行PCR擴增，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見一約1 306 bp的目的條帶(圖1)，以構建好的pUCm-T/S經EcoR I、XhoI雙酶切鑒定，酶切后的產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見一約1 306 bp的目的條帶，與預期值一致。

2.2 pGEX-6P-2/S的構建與鑒定 以抽提后的質粒pGEX-6P-2/S為模板，以pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R為引物進行PCR擴增，可見一約1 306 bp的目的條帶(圖1)，與預期值一致。用限制性內切酶EcoRⅠ、XholⅠ對重組質粒pGEX-6P-2/S進行雙酶切，得到與目的基因(1 306 bp)及載體(4 985 bp)相同大小的2個片段(圖1)。挑取含插入片段pGEX-6P-2/S的陽性克隆，用小量質粒提取試劑盒提取質粒測序，結果表明S基因片段已經成功的插入pGEX-6P-2載體，且插入方向正確。

2.3 測序結果分析 核蛋白基因編碼區以起始密碼ATG開始，以終止密碼子TAA結尾，ORF長1 290個核苷酸殘基，包括堿基A423個(32.79%)，堿基C244個(18.91%)，堿基G325個(25.19%)，堿基T298個(23.10%)，GC含量為44.11%，AT含量為55.89%，單鏈分子量約為391.41 kDa，編碼429個氨基酸(20種)，平均分子量為48.13 kDa，含量最高的氨基酸為Leu(亮氨酸)，占總蛋白含量的9.79%(42/429)，含量最低的為Cys(半胱氨酸)和Trp(色氨酸)，僅各占1.17%(5/429)。

2.4 pGEX-6P-2/S的表達與鑒定 含重組質粒pGEX-6P-2/S的E.coliStarTMBL21(DE3)菌株應用不同濃度IPTG進行誘導，SDS-PAGE凝膠電泳圖上均顯示特異性條帶，蛋白分子量與理論值一致，約為74 kDa。菌株在IPTG終濃度0.8 mmol/L、37 ℃條件下誘導5 h條件下，表達量最大(圖2)。菌體經超聲波破菌，包涵體經8 mol/L尿素溶解后過GST親和層析柱，SDS-PAGE凝膠電泳顯示單一的目的蛋白條帶，分子量與預期大小一致，約74 kDa，融合蛋白主要存在于不溶性的包涵體中。

2.5 NP蛋白的純化與Western blot鑒定 A280紫外分光光度法測得蛋白濃度為1.80 mg/mL。蛋白復性后經GST蛋白純化柱純化，SDS-PAGE凝膠電泳顯示蛋白分子量約74 kDa(圖3)；以抗GST McAb為一抗、HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗的Western blot在相應位置出現特異性條帶。

2.6 重組蛋白免疫原性 重組蛋白免疫新西蘭兔4次后，間接ELISA法檢測血清中特異性IgG和IgM抗體顯著升高，其效價分別達到1∶16 000和1∶8 000以上，血清陽性反應率為6/6。同時陰性對照組兔免疫4次后，血清中未檢出抗GST-NP特異性抗體。

M:1 kb DNA ladder；1:PCR陰性對照；2:RT-PCR；3:重組質粒pGEX-6P-2/S為模板的PCR產物；4:空質粒pGEX-6P-2；5:重組質粒pGEX-6P-2/S；6:重組質粒pGEX-6P-2/S經EcoR I、Xho I雙酶切；7:重組質粒pUCm-T/S經EcoR I、Xho I雙酶切M: 1kb DNA ladder；1:PCR negative control；2:RT-PCR；3:PCR products of recombinant plasmid pGEX-6P-2/S；4:Plasmid of pGEX-6P-2；5: Recombinant plasmid of pGEX-6P-2/S；6: Recombinant plasmid of pGEX-6P-2/S digested by EcoR I and Xho I；7: Recombinant plasmid pUCm-T/S digested by EcoR I and Xho I圖1 S基因原核重組質粒pGEX-6P-2/S構建(8 cm length gel,1×TAE,7V/cm,45 min)Fig.1 Construction of the prokaryotic expression recombinant plasmid of pGEX-6P-2/S

M：蛋白Marker;1-6: 0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L IPTG誘導pGEX-6P-2/S；7：空質粒pGEX-6P-2；8：空菌E.coli BL21 StarTM(DE3)；9：pGEX-6P-2/S未經IPTG誘導M：Protein Marker,1-6: 0.2 mmol/L,0.4 mmol/L,0.6 mmol/L,0.8 mmol/L,1.0 mmol/L,1.2 mmol/L IPTG induced pGEX-6P-2/S,7：Plasmid of pGEX-6P-2,8：E.coli BL21 StarTM(DE3),9：pGEX-6P-2/S induced without IPTG圖2 重組質粒pGEX-6P-2/S在大腸桿菌中的誘導表達(12%SDS-PAGE)Fig.2 Recombinant plasmid pGEX-6P-2/S expressed in Ecoli. BL21 StarTM(DE3)

M：蛋白Marker；1：pGEX-6P-2/S未經IPTG誘導；2：pGEX-6P-2/S經1.0 mmol/L IPTG誘導；3：過GST蛋白純化柱前；4：過GST蛋白純化柱后；5：第一次洗脫液，6：第二次洗脫液M：Protein Marker，1：pGEX-6P-2/S induced without IPTG，2：pGEX-6P-2/S induced with 1.0 mmol/L IPTG，3:Induced products of pGEX-6P-2/S before purification，4：Induced products of pGEX-6P-2/S after purification，5：The first eluant，6：The second eluant圖3 Hunan03株漢坦病毒核蛋白純化效果分析(12%SDS-PAGE)Fig.3 The purification of hantavirus nucleoprotein of Hunan03(12%SDS-PAGE)

1：pGEX-6P-2/S經0.8 mmol/L IPTG誘導表達產物；2：純化后的pGEX-6P-2/S重組蛋白；3：pGEX-6P-2/S無IPTG誘導產物1：The expression product of recombinant plasmid of pGEX-6P-2/S with 0.8 mmol/L IPTG，2：Purified recombinant pGEX-6P-2/S nucleoprotein，3：The expression product of recombinant plasmid of pGEX-6P-2/S without IPTG圖4 Hunan03株漢坦病毒核蛋白免疫印跡分析Fig.4 Immunoblot analysis of hantavirus recombinant nucleoprotein of Hunan03

表1 ELISA法檢測新西蘭兔免疫血清中GST-NP特異性抗體滴度及陽性反應率
Tab.1 Specificity antibody titer in New Zealand rabbit serum detected by ELISA and the positive rate analysis

分組Groups新西蘭兔(只)No.ofNewZealandrabbitIgM抗體滴度TiterofIgMIgG抗體滴度TiterofIgG陽性率(%)Positiverate(%)免疫組Immunegroup6≥1∶8000≥1∶160006/6(100%)緩沖液對照組Buffersolutioncontrol2--0/2(0)GST對照組GSTcontrol2--0/2(0)

注：結果以待測標本平均A450值/陰性對照A450值≥2.1為陽性,以出現陽性反應的最高稀釋度作為該血清的滴度。

Note:If the ratio of the absorbance value of the sample to the negative control at 450nm was ≥2.1,the sample was considered as positive, and the highest serum dilution was the serum’s titer.

3 討 論

不同株、型的漢坦病毒核蛋白氨基酸序列相對保守，均攜帶有T細胞和B細胞抗原決定簇，能誘導機體產生特異性體液免疫應答和細胞免疫應答，可直接與體外轉錄病毒的RNA及被感染細胞的細胞器結合，起著調節病毒復制的作用[6]。以前漢坦病毒感染后的血清學診斷所用抗原常為病毒感染的組織細胞，其敏感性、特異性和可操作性不是十分理想，免疫印跡實驗表明重組的完整核蛋白或截短的核蛋白均具有良好的免疫原性和免疫反應性，可替代天然抗原用于漢坦病毒感染的實驗室診斷[7]。

前期研究表明Hunan03株來源于野生黑線姬鼠，屬漢坦病毒HTN型，S基因編碼的核蛋白由428～433個氨基酸組成，相對分子量為49～51 kDa，基因片段抗原位點呈非構象依賴性。在感染細胞內過量表達時由于肽鏈的合成速度過快且缺乏足夠的時間和空間進行折疊和盤曲，可形成顆粒狀包涵體[8]。本研究通過對漢坦病毒S基因的ORF區域進行克隆、測序和表達，獲得了一分子量約74 kDa的GST-NP融合蛋白，SDS-PAGE試驗表明融合蛋白以包涵體形式存在于菌體中，由于包涵體組織結構穩定，實驗中應用低濃度的表面活性劑十二烷基磺酸鈉和低濃度的變性劑尿素等在低能量的超聲波中除去了大部分雜質，采用含Triton X-100、EDTA的洗滌液洗滌包涵體，大部分雜蛋白得到了洗脫，用含8 mol/L尿素的溶解液對包涵體進行了較好的溶解。pGEX-6P-2載體自身攜帶有分子量為26 kDa的在解毒過程中起重要作用的谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)，具有增加外源基因的表達、提高表達蛋白的可溶性和易純化的特點，我們應用GST瓊脂糖凝膠純化柱一步分離到了純度較高的目的蛋白。

包涵體蛋白的復性是一個費時且效率較低的過程，經常會導致重組蛋白的損失，是基因工程研究領域的瓶頸。本研究經條件摸索后發現：采用緩慢透析法、氧化型和還原型谷胱甘肽相結合的方法對漢坦病毒核蛋白復性非常有效。即在4 ℃條件下，用8 mol/L Urea溶液作為起始透析液，然后逐漸降低透析液的尿素濃度，由于尿素濃度下降連續緩慢，減少了復性過程中蛋白沉淀，提高復性蛋白回收率。研究中還發現核蛋白含有較多的二硫鍵，我們通過在復性緩沖液中加入2 mol/L還原型谷胱甘肽GSH和0.2 mol/L氧化型谷胱甘肽 GSSG，能有效促進二硫鍵的形成，有利于漢坦病毒核蛋白恢復其天然的空間結構，從完全伸展的變性狀態恢復到正常的折疊結構，最大程度地恢復了變性后重組蛋白的生物活性。

將GST-NP重組蛋白包被酶標板，以羊抗兔IgG-HRP和IgM-HRP為二抗，建立的間接ELISA法檢測免疫45 d之后的兔血清，IgG和IgM抗體其效價分別達到1∶16 000和1∶ 8 000以上，血清陽性反應率為100%。說明重組蛋白GST-NP具有較好的免疫原性和免疫反應性，為后續漢坦病毒單克隆抗體的制備奠定了基礎。

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Cloning and expression of hantavirus nucleoprotein gene of Hunan03 and its immunogenicity

CAI Liang1,2, ZHANG Hong1, GAO Li-dong1, LIU Jian-gao1,QIN Di1,HE Fang-ling1, LIU Jia-hui1, ZOU Yi-zhou2, LI Jun-hua1

(1.HunanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,theKeyLaboratoryofMicrobialMolecularBiologyofHunanProvince,Changsha410005,China;2.SchoolofBasicMedicalScience,CentralSouthUniversity,Changsha410013,China)

We cloned the hantavirus nucleoprotein gene and expressed it inE.colifor laboratory diagnosis. The whole open reading frame(ORF)of hantavirus Hunan03 strain S gene was amplified by RT-PCR after designing specific primers, and the PCR products was cloned into the pGM-T vector and transformed into competent cell of TOP10 and identified by the assay of blue-white spot screening, PCR and enzyme digestion. Then, we directed cloned the S gene into the prokaryotic expression vector of pGEX-6p-2 and the recombinant plasmid of pGEX-6p-2/S was transformed into the competent cell ofE.coliBL21 StarTM(DE3) and induced by IPTG. We identified the expression product by SDS-PAGE and Western-blot. Results showed that the PCR product of S gene was about 1 306 bp. The recombinant plasmid of pGEX-6p-2/S was constructed successfully after being identified by PCR and double enzyme digestion. Under the condition of 37 ℃ and 0.8 mmol/L IPTG induction, the pGEX-6p-2/S has expressed a 74 kDa fusion GST-NP protein. The successful expression of the recombinant prokaryotic plasmid pGEX-6p-2/S will benefit to the laboratory diagnosis of hantavirus infection.

hantavirus; nucleoprotein gene; prokaryotic expression; Nucleoprotein immunogeicity

李俊華，Email: hncdc＿ljh@163.com

鄒義洲，Email:289034452@qq.com

1. 湖南省疾病預防控制中心，湖南省微生物分子生物學重點實驗室，長沙 410005；

2. 中南大學基礎醫學院，長沙 410013

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.006

373

A

1002-2694(2016)08-0711-06

2016-03-29；

2016-05-19

湖南省科技廳科研基金(No.2013TT2016)資助

Supported by the Project of the Scientific & Technological of Hunan province (No.2013TT2016).Corresponding authors: Li Jun-hua, Email: hncdc_ljh@163.com；Zou Yi-zhou, Email: 289034452@qq.com