頭花蓼對幽門螺桿菌粘附定植的影響

張 姝,羅昭遜,莫 非，何 蕓，孫朝琴,張婉穎,曹玉巧，張 嵐

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頭花蓼對幽門螺桿菌粘附定植的影響

張 姝1,羅昭遜2,莫 非1，何 蕓1，孫朝琴2,張婉穎1,曹玉巧1，張 嵐1

目的 觀察頭花蓼水提物對幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)粘附定植的影響。方法 采用尿素酶活性比色法定量檢測頭花蓼水提物作用前后幽門螺桿菌尿素酶活性的影響；運用半固體布氏瓊脂平板法檢測不同濃度頭花蓼對幽門螺桿菌鞭毛運動的影響；利用細胞爬片革蘭染色觀察不同濃度頭花蓼作用后幽門螺桿菌在GES-1細胞表面粘附的變化并計算各組抑制率；采用Real-time PCR 技術檢測頭花蓼作用前后相關基因ureB、ureE、ureF、flaA、flaB、babA、alpA、alpB的mRNA轉錄水平。結果 頭花蓼水提物對幽門螺桿菌尿素酶活性具有抑制作用，抑制率為44.90±0.289。頭花蓼濃度為1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC分別作用后幽門螺桿菌菌膜暈圈直徑顯著小于對照組, 分別為(5.67±0.55)mm ,(8.5±0.50)mm ,(11.67±1.53)mm,差異有統計學意義(P<0.05)；不同濃度頭花蓼水提物均能抑制細菌粘附胃上皮細胞，各濃度組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。頭花蓼作用后，與對照組比較，下調了尿素酶結構基因ureB，尿素酶活性基因ureE、ureF、鞭毛相關基因flaB、flaA以及粘附素基因babA、alpA、alpBmRNA的轉錄水平，差異均具有統計學意義(P<0.05)。結論 頭花蓼對幽門螺桿菌具有明顯的抑制作用，是通過抑制幽門螺桿菌尿素酶活性，減緩幽門螺桿菌的鞭毛動力，影響幽門螺桿菌對胃粘膜上皮細胞的粘附等方面發揮其抑菌作用。

幽門螺桿菌；頭花蓼；尿素酶；鞭毛；粘附；

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)的發現革命性改變很多胃腸疾病的基本理論，根除幽門螺桿菌治療廣泛應用于這些疾病的防治。幽門螺桿菌呈螺旋形，有鞭毛、適應性酶和粘附素，這使它能在胃腔不利的酸性環境中定植和生存[1]。因此，成功定植于胃粘膜細胞是整個致病過程中前提和關鍵，粘附定植的過程可作為我們根治幽門螺桿菌感染研究的一個新的靶點。參與整個定植和生存的因素包括：尿素酶的活性[2-3]、鞭毛動力[4-5]以及粘附性影響[1]。

本課題組在前期的研究中發現頭花蓼水提物在體外對幽門螺桿菌具有良好的抑菌活性[6],同時發現其作用可減少幽門螺桿菌在小鼠胃粘膜上的定植密度，但具體的機制尚不清楚。因此，本研究在前期研究的基礎上，在體外觀察頭花蓼水提物作用對幽門螺桿菌尿素酶活性和鞭毛動力的影響；并以人永生化胃上皮細胞GES-1為靶細胞，通過細胞爬片實驗觀察不同濃度頭花蓼水提物對幽門螺桿菌粘附胃粘膜上皮細胞的粘附能力的影響；Real-time PCR檢測頭花蓼水提物作用前后粘附定植相關因子基因的mRNA轉錄水平，探討頭花蓼水提物抑制幽門螺桿菌成功定植的作用機制，為頭花蓼的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 幽門螺桿菌ATCC700392國際標準測序株，購自ATCC(美國菌種保藏中心)，由本課題組保管。

1.1.2 實驗藥材 水提苗藥頭花蓼浸膏粉，棕色粉末，批號為20010401，由浙江眾益藥業有限公司提供。1.1.3 試劑 布氏肉湯干粉、哥倫比亞血瓊脂粉、腦心浸液粉，Oxoid；觸酶、氧化酶、尿素酶購自于梅里埃；細菌活性蛋白提取試劑盒及尿素酶活性定量檢測試劑盒；RNA反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備

1.2.1.1 固體培養平板的制備按說明書方法，稱取哥倫比亞血瓊脂粉3.9 g，加入84 mL去離子水溶解，高壓滅菌(121 ℃，20 min)，待瓊脂冷卻至56 ℃左右加入無菌脫纖維綿羊血10 mL，混抗1 mL，實驗組分別加入5 mL濃度為40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL頭花蓼藥液，使其平板濃度分別為1/2MIC(2 mg/mL)、1/4MIC(1 mg/mL)、1/8MIC(0.5 mg/mL)，對照組加無菌去離子水，充分混勻后傾倒于直徑為90 mm的無菌平皿中，培養基厚度約為3～4 mm。

1.2.1.2 半固體瓊脂平板的制備 稱取布氏肉湯干粉1.405 g，哥倫比亞瓊脂粉0.45 g于錐形瓶中，加入去離子水44.5 mL溶解，此為對照組；實驗組則是加入39.5 mL水溶解。高壓滅菌(121 ℃，20 min)處理。待瓊脂冷卻至56 ℃左右時加入無菌脫纖維綿羊血5 mL，混抗0.5 mL，實驗組需再分別加入5 mL濃度為40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL頭花蓼液，使其平板濃度分別為4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL充分混勻后傾倒于直徑為90 mm的無菌平皿中，培養基厚度約為3 mm～4 mm，使其成為含10%脫纖維羊血的布氏肉湯半固體培養基。

1.2.2 尿素酶蛋白活性的檢測 刮取對數生長期幽門螺桿菌于腦心浸液肉湯中制備成濃度為1～9×108cfu/mL菌懸液，無菌棉簽涂布于空白平皿及含2 mg/mL頭花蓼藥平皿上，置于微需氧環境中37 ℃培養72 h，同樣操作傳代于新的平皿，共培養3代后，分別取100 mg于預冷的無菌PBS中。5 000 g離心5 min收集菌體，根據試劑盒說明提取總蛋白。BCA法測定蛋白質含量。參照Rokita E推薦的方法，根據GENMED細菌尿素酶活性比色法定量檢測試劑盒檢測幽門螺桿菌的尿素酶活性。尿素酶活性的抑制率=(對照組-實驗組)/對照組100%

1.2.3 細菌鞭毛動力定量檢測 收集培養48 h生長狀態良好的幽門螺桿菌懸于腦心浸液，調整菌液濃度至3×108CFU/L。菌液保存在4 ℃備用。取10 μL分別穿刺接種于實驗組(含頭花蓼藥液)和對照組(含等量無菌去離子水)的布氏肉湯半固體瓊脂血平板上，相同濃度的各接種2個，置于37 ℃培養箱中培養5 d。分別測量實驗組和對照組含藥培養基上幽門螺桿菌菌膜暈圈的直徑(直尺量其直徑)。

1.2.4 頭花蓼水提物對幽門螺桿菌粘附GES-1細胞粘附抑制實驗

1.2.4.1 菌液的制備 刮取對數生長期幽門螺桿菌，對照組：用不含雙抗細胞完全培養基調節菌液濃度為2×106cfu/mL，藥物組：分別用含藥濃度為128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL的無雙抗細胞完全培養基溶液調節菌液濃度為2×106cfu/mL。

1.2.4.2 細胞的培養 從-80 ℃液氮罐中取出凍存管，迅速置于37 ℃水浴箱，輕輕搖動使其盡快融化。用一次性吸管吸取細胞懸液，注入預加有6 mL細胞培養基的離心管中，混合后，1 000 rpm/min，離心5 min，去除上清。將細胞接種于5 mL10% DMEM完全培養基中，置于37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養。觀察細胞的形態。

1.2.4.3 爬片實驗觀察細胞的粘附 按照文獻方法[7-8]，采用對數生長期的GES-1細胞，PBS洗滌細胞3次，胰酶消化，離心收集細胞，用不含雙抗細胞完全培養基調節細胞濃度至2×104個/mL，加入到放置有無菌蓋玻片的6孔板中，每孔2 mL，在37 ℃細胞培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后，用PBS洗滌兩次，實驗組分別加入含頭花蓼濃度為128 μg/ mL、64 μg/ mL、32 μg/ mL、16 μg/ mL細胞培養基配制的2×106cfu/mL的菌懸液2 mL，對照組加入不含藥物培養基配制的幽門螺桿菌菌懸液2 mL(設每個濃度做5個復孔)，放入37 ℃細胞培養箱中繼續培養2 h后，取出用PBS洗滌3次，取出蓋玻片，自然干燥、甲醇固定15 min，PBS漂洗一次，以便漂掉蓋玻片上未粘附幽門螺桿菌，然后用革蘭染色，油鏡下觀察計數每個細胞上粘附的細菌數，每組計數30個細胞。計算每個細胞粘附細菌平均數，分析并計算抑制率。抑制率=(對照組-實驗組)/對照組100%。實驗重復3次。

1.2.5 實時熒光定量PCR 檢測幽門螺桿菌粘附定植相關基因表達水平

1.2.5.1 幽門螺桿菌總RNA提取 在頭花蓼水提物終濃度為2 mg/mL平板上培養至48 h后的幽門螺桿菌ATCC 700392設為實驗組，同批未經頭花蓼處理的幽門螺桿菌ATCC 700392為對照組。將對照組與實驗組標本用腦心浸液肉湯調試細菌懸液至1～9×107CFU/mL，采用Trizol法提取各組樣品的總RNA。

1.2.5.2 實時熒光定量PCR：將各組的幽門螺桿菌RNA按照TaKaRa試劑盒說明書分別進行反轉錄cDNA后，以其為模板,以16SrRNA基因作為內參,運用SYBR ○R Premix Ex TaqTMII試劑盒在ROCHE Light Cycler480熒光定量PCR儀上檢測鞭毛相關基因flaA、flaB,尿素酶活性基因ureE、ureF及粘附素基因babA、alpA、alpB引物設計采用的Primer Primer 5.0軟件。相關基因引物序列見表1。引物委托上海生工公司合成。25 μL PCR反應體系：目的基因的上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ(2X) 12.5 μL, RNase Free ddH2O 8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.5 μL。反應條件為: 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。每一個樣品3個技術重復，每組做3個生物重復。每次PCR反應均設置陰性對照(ddH2O代替cDNA 模板)。采用比較2-△△CT法，對目標基因進行相對定量分析。

表1 PCR引物序列
Tab.1 Primers sequence of PCR

基因名稱(Gene)引物序列(5'to3')(Primersequence)產物長度(bp)(Productlength)16SrRNA-FCCGCCTACGCGCTCTTTAC10016SrRNA-RCTAACGAATAAGCACCGGCTAACflaA-FATTGGCGTGTTAGCAGAAGTGA99flaA-RTGACTGGACCGCCACATCflaB-FACATCATTGTGAGCGGTGTGA95flaB-RGCCCCTAACCGCTCTCAAATbabA-FTGCTCAGGGCAAGGGAATAA95babA-RATCGTGGTGGTTACGCTTTTGalpA-FGCACGATCGGTAGCCAGACT90alpA-RACACATTCCCCGCATTCAAGalpB-FACGCTAAGAAACAGCCCTCAAC82alpB-RTCATGCGTAACCCCACATCAureFFGGGGCTTGTGGATAGCATAA206ureFRCGCATTCTTTTGGGCTAGAAureEFTCTTGGCTTGGATGTGAATG185ureERGGAATGGTTTGAAACGAGGAureBFGGTCCTGCTGATGGCACTA236ureBRGCGTCGTTAGAAGCGTTACG

3 結 果

3.1 頭花蓼水提物對細菌尿素酶活性的影響 采用尿素酶活性比色法檢測實驗組和對照組的尿素酶活性，顯示頭花蓼作用后幽門螺桿菌尿素酶活性與對照組相比顯著降低，為184.78 mIU/min±4.74 mIU/min，差異具有統計學意義(P<0.05)。實驗組與對照組的尿素酶活性抑制率為44.90±0.289。見圖1。

圖1 頭花蓼對幽門螺桿菌尿素酶活性的影響Fig.1 Effect of P. capitatum on H. pylori urease activity

3.2 苗藥頭花蓼作用對幽門螺桿菌鞭毛動力的影響 幽門螺桿菌在半固體培養基上培養5 d后，測量結果顯示1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC頭花蓼作用后幽門螺桿菌菌膜暈圈直徑顯著小于對照組, 差異有統計學意義(P<0.05)。藥物濃度的越大，幽門螺桿菌菌膜暈圈直徑越小。表明苗藥頭花蓼可降低幽門螺桿菌鞭毛動力，且幽門螺桿菌鞭毛動力的抑制程度與苗藥頭花蓼藥物濃度呈劑量相關性。見表2。

表2 頭花蓼作用前后幽門螺桿菌菌膜圈直徑的變化
Tab.2 Primers sequence of PCR

組別Group菌膜圈直徑(mm)Bacterialcirclediameter對照組16.00±1.001/8MIC組11.67±1.53*1/4MIC組8.50±0.50*1/2MIC組5.67±0.55*

*與空白組相比P<0.05

3.3 不同頭花蓼藥物濃度對細菌粘附的影響 各藥物濃度作用下，細菌對細胞的粘附情況見圖2。A圖為GES-1細胞在低倍鏡下的正常形態。油鏡下，對照組可見幽門螺桿菌局灶性粘附GES-1細胞的一側，呈現趨向性。不同濃度(16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL)頭花蓼對幽門螺桿菌粘附GES-1細胞均有抑制作用，細胞上粘附的細菌數均顯著減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。粘附細菌數量隨著藥物濃度的增加而減少，在128 μg/mL頭花蓼組粘附的細菌數量最少。粘附呈彌漫性粘附，無規則地粘附在GES-1細胞表面。見表3。

注：A細胞爬片革蘭染色(×100)； B對照組(×1 000)；C為16 μg/mL頭花蓼處理組(×1 000) ；D為32 μg/mL頭花蓼處理組(×1 000)；E為64 μg/mL頭花蓼處理組(×1 000)；F為128 μg/mL頭花蓼處理組(×1 000)A：Cell slide Gram stain(×100)，B: The control group A: experimental group(×1 000)，C：The 16 μg/mL P. capitatum group(×1 000)，D：The 32 μg/mL P. capitatum group；(×1 000)，E：The 64 μg/mL P. capitatum group(×1 000)，F：The 128 μg/mL P. capitatum group(×1 000)圖2 不同頭花蓼濃度對幽門螺桿菌粘附的影響Fig.2 Effect of different concentration of P. capitatum on H. pylori adhesion to cells

表3 不同頭花蓼藥物濃度對細菌粘附的影響
Tab.3 Effect of different concentration of P. capitatum on H. pylori adhesion to cells

頭花蓼濃度P.capitatumconcentration對照組Thecontrolgroup16μg/mL32μg/mL64μg/mL128μg/mL粘附細菌數/個Numberofadherentbacteria58.5±4.5534.50±4.55*26.40±2.81*18.37±3.88*13.4±1.90*抑制率Inhibitionrate—0.410.550.690.77

*P<0.05vs control group

3.4 頭花蓼作用對定植相關基因轉錄水平的影響 以16SrRNA 基因作為內參，采用2-ΔΔCT法對頭花蓼對幽門螺桿菌作用后對定植相關基因表達差異進行分析。在頭花蓼作用幽門螺桿菌前后，尿素酶基因ureB、ureE、ureF，鞭毛相關基因flaA、flaB，粘附素基因babA、alpA、alpB均有表達，其中對照組與實驗組相比其表達量有顯著差異(P<0.05)，且對照組>實驗組。其中babA基因變化下調最為明顯，為17.3倍。見圖4。

圖4 頭花蓼對幽門螺桿菌粘附定植相關基因mRNA轉錄的影響Fig.4 Effect of P. capitatum on Transcription of genes related to H. pylori colonization

4 討 論

幽門螺桿菌的致病機制包括諸多環節，其中定植是致病的關鍵，而粘附是定植的前提，幽門螺桿菌之所以能夠在胃腸蠕動是不會與食物一起驅除的原因是幽門螺桿菌的動力比其他菌種強，這使幽門螺桿菌能夠快速穿過胃腔的酸性環境達到中性的粘液層中，并穿過粘稠的粘液層，定植與胃黏膜上，幽門螺桿菌可產生大量的尿素酶，約占菌體總蛋白的10%[9]。尿素酶是幽門螺桿菌產生的一種能將尿素水解為氨和二氧化碳的酶，在菌體周圍形成“氨云”，使pH值升高引起的低酸可降低黏液中黏蛋白的含量，破壞黏液的離子完整性，削弱胃黏膜屏障功能，使細菌能夠順利穿過胃黏液層到達胃黏膜表面[10-11]。他對于幽門螺桿菌的定植和生存起著重要的作用。抗潰瘍藥物依卡倍特可通過抑制幽門螺桿菌的尿素酶活性抑制幽門螺桿菌定植而達到輔助治療幽門螺桿菌慢性胃炎等消化性疾病[12]。幽門螺桿菌尿素酶基因族共包含九個基因，其中ureE、ureF為尿素酶活性基因，他們一起為尿素酶的活性表達所必須[13]。本研究采用比色法檢測實驗組與對照組的尿素酶活性，觀察到在頭花蓼的作用下，尿素酶活性降低。同時檢測幽門螺桿菌尿素酶活性蛋白基因ureE、ureFmRNA水平與平行培養的對照組相比分別下調3.77倍和5.09倍。因此推測苗藥頭花蓼除了通過抑制尿素酶活性降低其催化效率外，還通過影響尿素酶基因的轉錄，降低幽門螺桿菌尿素酶的生成量降低幽門螺桿菌對尿素酶的催化效率，進而降低幽門螺桿菌在胃的生存能力。

當幽門螺桿菌進入胃后，在尿素酶提供的微環境前提下，鞭毛的擺動使細菌作旋轉前進，穿透覆蓋于胃粘膜上皮細胞的粘液層。故認為鞭毛的動力可直接影響菌株在宿主的定植及生存能力。菌株動力性與其在宿主的感染率成正比，動力極強的菌株感染率可達100%,無鞭毛菌株或鞭毛突變株則不能成功定植于胃黏膜。幽門螺桿菌的鞭毛蛋白由2個鞭毛素基因falA和flaB編碼的FalA、FlaB蛋白多聚體組成。這兩種鞭毛蛋白對于細菌的運動均是必須的。本研究中，幽門螺桿菌含苗藥頭花蓼水提取的半固體瓊脂平板上的游泳運動能力明顯小于對照組，說明其可降低細菌的游泳動力。熒光定量PCR檢測結果顯示頭花廖可顯著下調flaA、flaB基因的表達。推測苗藥頭花蓼作用可能通過影響幽門螺桿菌鞭毛相關基因falA、flaB影響其編碼FalA、FlaB鞭毛蛋白的從而抑制幽門螺桿菌的運動能力。

在尿素酶提供的微環境和鞭毛提供動力下，幽門螺桿菌順利到達相對中性的胃粘膜表面，此時幽門螺桿菌通過粘附素特異性的直接與宿主細胞、粘蛋白等結合使幽門螺桿菌能在宿主體內長期生存。幽門螺桿菌這種特異性的粘附反映了它存在粘附因子，其中最為重要是BabA，AlpA和AlpB。BabA是血型抗原結合性粘附素，介導幽門螺桿菌的初始粘附[14]。AlpA和AlpB由高度同源的基因alpA和alpB編碼，alpA、alpB主要與宿主的黏連蛋白層結合介導細菌與胃粘膜組織的粘附，當alpA和alpB缺失情況下，可以減少幽門螺桿菌在動物的定植量[15]在體外細胞爬片實驗中觀察，頭花蓼作用后幽門螺桿菌對GES-1細胞的粘附數量減少，表明頭花蓼可以抑制幽門螺桿菌對GES-1細胞的粘附。熒光定量PCR檢測頭花蓼作用前后粘附素BabA、AlpA、AlpB的基因水平，頭花蓼作用后粘附素BabA、AlpA、AlpB的mRNA水平均下調，差異均具有統計學意義。推測當苗藥頭花蓼作用通過抑制babA基因表達影響幽門螺桿菌表面粘附素BabA的生成量，由BabA介導的細菌初始粘附能力降低。同時等位基因編碼的alpA、alpB粘附素基因表達同樣受到抑制，alpA、alpB的抑制可降低細菌在胃粘膜的定植量。

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Luo Zhaoxun,Email：2860330236@qq.com

Influence ofPolygonumcapitatumon the adherency and colonization ofHelicobacterpylori

ZHANG Shu1,LUO Zhao-xun2,MO Fei1,HE Yun1,SUN Chao-qin2,ZHANG Wan-ying1,CAO Yu-qiao1,ZHANG Lan1

(1.BiochemistryAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversityGuiyang550004,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

We aimed to observe the influence ofP.capitatumon adherency and colonization ofH.pylori. Urease active colorimetric method would be adopted to quantitatively detect the influence on urease activity ofH.pyloribefore and after the function ofP.capitatum; semi-solid Brucella agar plate method would be used to detect the influence on flagellar movement ofH.pyloribefore and after the function ofP.capitatum; Gram’s stain of cell slides would be utilized to observe the changes of different concentrations ofP.capitatumandH.pylorion the bacteria adhered on the surface of GES-1 cells and calculate the inhibition ratio of all groups; real-time PCR technologies would be adopted to detect the expression level of related genes ofureE,ureF,flaA,flab,babA,alpAandalpBbefore and after the function ofP.capitatum.P.capitatumhad inhibition effect on urease activity ofH.pyloriwith the inhibition ratio being 44.90±0.289. The concentration ofP.capitatumwas respectively 1/2MIC, 1/4MIC and 1/8MIC; after respective function, the diameter ofH.pyloripellicle halo was significantly smaller than that of the control group, respectively (5.67±0.55) mm, (8.5±0.50) mm and (11.67±1.53) mm with statistical difference (P<0.05); different concentrations ofP.capitatumcould all inhibit the bacteria to adhere to gastric epithelial cells and compared to the control groups, all concentration groups were with statistical difference (P<0.05). After the function ofP.capitatum, compared to the control group, the expression level of urease active genesureEandureF, flagellin genes flab and flaA as well as adhesion genesbabA,alpAandalpBmRNA was reduced with statistical difference (P<0.05). It came to the conclusion thatP.capitatumhas obvious inhibition effect onH.pylori, which exerts its antibacterial effect via inhibiting urease activity ofH.pylori, slowing down the flagella movement ofH.pyloriand impacting the adherence ofH.pylorito gastric epithelial cells.

Helicobacterpylori,Polygonumcapitatum,ureases,flagella；adherence

2014年地方高校國家級大學生創新創業訓練計劃項目(No.201410660014)和2014年貴州省大學生創新創業訓練計劃項目(No.201410660014)聯合資助

羅昭遜，Email：2860330236@qq.com

1.貴州醫科大學臨床檢驗教研室，貴陽 550004；

2.貴州醫科大學附屬醫院檢驗科，貴陽 550004

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.010

R378

A

1002-2694(2016)08-0734-07

2016-02-21；

2016-04-20

貴州省科技合作計劃基金(No.黔科合LH(2015)7417號)；貴州省衛生計生委科學技術基金(No.gzwjkj2015-1-003)

Supported by the Special Funds for the Joint Fund from the Scientific and Technological Cooperation Plan Fund in Guizhou (No.Qian Scientific Cooperation LH (2015) 7417),the Joint Fund from the Science and Technology Fund at Sanitation and Family Planning Commission in Guizhou (No.gzwjkj2015-1-003),the Joint Fund from the Science and Technology Plan Project in Guiyang (Construction Scientific Cooperation [No.20141001]);the Joint Fund from the,National University Student Innovation and Entrepreneurship Training Program in local universities in 2014 (No.201410660014)the Joint Fund from the University Student Innovation and Entrepreneurship Training Program in Local Universities in 2014 (No.201410660014)