PCR技術(shù)在野生動物疫源疫病檢測中的應(yīng)用

王軻,王亮

(天津市濱海新區(qū)塘沽林業(yè)工作站,天津 300450)

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PCR技術(shù)在野生動物疫源疫病檢測中的應(yīng)用

王軻,王亮

(天津市濱海新區(qū)塘沽林業(yè)工作站,天津 300450)

摘要：指出了野生動物疫源疫病檢測工作在整個野生動物疫源疫病監(jiān)測防控體系中占據(jù)著非常重要的作用,介紹了在疫源疫病檢測中常用的PCR方法,包括普通RT-PCR、免疫PCR和實時熒光定量PCR等,以期為野生動物疫源疫病的檢測提供參考。

關(guān)鍵詞：疫源疫病;PCR;檢測,實時熒光定量

1引言

野生動物疫源疫病監(jiān)測防控是當(dāng)前林業(yè)工作的一項重要任務(wù),包含了監(jiān)測、檢測、預(yù)警和防控等一系列工作,其中檢測工作在整個野生動物疫源疫病監(jiān)測防控體系中發(fā)揮著非常重要的作用。野生動物疫源疫病檢測分為常規(guī)檢測和疫情檢測,常規(guī)檢測主要是在野生動物疫源疫病流行高峰期,對救治的野生動物和隨機捕捉的野生動物進行糞便、血液和羽毛采樣并檢測;疫情檢測是對死亡的野生動物進行采樣檢測,分析確定是否發(fā)生疫情。

野生動物疫病種類繁多,危害性大,在野生動物種群之間傳播速度快,且易傳染給人類,威脅社會公眾衛(wèi)生安全。如高致病性禽流感是危害野生候鳥最常見的高度接觸性、急性傳染病,近幾年我國出現(xiàn)多次人感染高致病性禽流感的案例,嚴(yán)重威脅社會安全。因此,完善野生動物疫源疫病監(jiān)測防控體系,建立野生動物疫源疫病檢測專業(yè)實驗室,提高檢測水平,對于保護野生動物資源和社會生態(tài)安全有著非常重要的作用。PCR技術(shù)是一種基于DNA變性與復(fù)性原理,高效擴增體外特定DNA片段的技術(shù)[1],這種技術(shù)具有快速高效、操作簡便、靈敏度高、特異性強、批量檢測和痕量檢測等特征,目前被應(yīng)用于生物學(xué)基因鑒定、實驗和疫源疫病檢測等領(lǐng)域。常規(guī)PCR是所有由PCR技術(shù)衍生出來的檢測方法的技術(shù),在野生動物疫源疫病檢測中常用的有普通RT-PCR技術(shù)、免疫PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)等。

2普通RT-PCR

反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)是將RNA的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增相結(jié)合,被廣泛應(yīng)用于基因診斷、病原微生物檢測等,相比傳統(tǒng)病毒分離鑒定試驗靈敏度高,特異性強,周期短,可以為病毒的早期診斷提供快速、準(zhǔn)確的方法。普通PCR技術(shù)已經(jīng)無法滿足多病原體的快速鑒別診斷,因此在常規(guī)RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來雙重和多重RT-PCR技術(shù),這種技術(shù)能在單個反應(yīng)體系中同時檢測多重病毒[6],具有高特異性、高效率、低成本等特點,適合大量樣本的檢測。

制定林業(yè)經(jīng)營方案必須要對資源蓄積消長情況作時間性分析比對。這些資源在每個時間段端點蓄積情況的精準(zhǔn)數(shù)據(jù)就來源于林業(yè)檔案記載。由此看來,林業(yè)檔案所反映的情況,必須要真實、可靠,既是對現(xiàn)實經(jīng)營提供科學(xué)的依據(jù),更是為備考的歷史資料作保存。做好林業(yè)檔案工作是對歷史真實性的負(fù)責(zé)。

3.4為制定區(qū)域性林業(yè)發(fā)展、環(huán)境保護等戰(zhàn)略性規(guī)劃提供依據(jù)

隨著計算機大數(shù)據(jù)庫的發(fā)展,林業(yè)檔案資料實施電子化管理,建立網(wǎng)絡(luò)化資源共享平臺,讓人類社會對林業(yè)事業(yè)的發(fā)展有著共同的認(rèn)識,讓林業(yè)檔案中的林業(yè)文化事業(yè)為社會經(jīng)濟繁榮發(fā)展作出重大貢獻。

4結(jié)語

(1)林業(yè)檔案是林業(yè)單位或管理部門不可缺少的寶貴財富資源和有價值的、歷史的文化遺產(chǎn),其價值不可估量。每個林業(yè)單位或管理部門都要投入必要的人力、物力、財力去完成。林業(yè)檔案工作必須要具有專業(yè)性、事業(yè)性強的人員才能勝任。

(2)林業(yè)檔案建設(shè)的目的在于其價值的利用。如何建立計算機大數(shù)據(jù)庫,建設(shè)網(wǎng)絡(luò)化平臺,還有待于我們?nèi)ミM一步研究。

參考文獻：

[1] 李瑞平,王洪靜,羅文娟,等.林業(yè)檔案管理工作存在的問題及對策分析[J].河北林果研究,2013(1):95～97.

[2] 羅寧.檔案信息資源開發(fā)利用工作淺析[J].黑龍江檔案,2010(2):102.

[3] 王晶,李曉華.談如何提高檔案管理工作水平[J].科技創(chuàng)新與應(yīng)用,2012(7):56～58.

[4] 薛濤.林業(yè)科技檔案的管理和開發(fā)利用[J].中國科技信息,2007(11):34.

周建紅[5]等應(yīng)用普通RT-PCR技術(shù)對40分禽類樣品進行H5亞型禽流感病毒檢測,實驗結(jié)果表明該方法可基本滿足當(dāng)前的檢測需要。張應(yīng)國[4]等利用多重RT-PCR技術(shù)在3～4 h內(nèi),完成對36株禽流感及其他病毒分離物檢測,結(jié)果顯示該方法可以快速、特異和敏感的鑒別和監(jiān)測A型及H9N2、H5N1亞型禽流感病毒。劉婧君[7]分別用單-RT-PCR和雙重RT-PCR技術(shù)對樣品中的禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒進行檢測,研究表明盡管該雙重RT-PCR方法比單～的RT-PCR檢測方法的敏感性下降了10倍,但建立的雙重RT-PCR技術(shù)仍具有極高的敏感性,特異性和快捷性,具有很高的實用價值。在H3N2亞型禽流感病毒檢測研究方面,劉婷婷[9]通過設(shè)計篩選2對引物和優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了一種雙重RT-PCR方法,能夠有效檢測臨床樣品。

3免疫PCR

免疫PCR (I mmuno polymerase chain reaction)技術(shù)是一種檢測微量蛋白的高靈敏度技術(shù),它將抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR反應(yīng)的敏感性有機結(jié)合起來,能夠檢出濃度低至2 ng/L的抗原物質(zhì),能夠有效解決普通RT-PCR方法存在的不足和弊端,在醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的使用研究取得了很好的效果。目前免疫PCR技術(shù)已經(jīng)開發(fā)出不同的種類,包括定量免疫PCR、雙相免疫PCR、磁性免疫PCR、免疫捕捉PCR、雙抗體夾心免疫PCR等。

目前盡管免疫PCR技術(shù)靈敏度非常高,正是由于其高敏感性和操作步驟的復(fù)雜性,使得免疫PCR技術(shù)在操作過程中容易受到交叉污染,影響檢測結(jié)果,因此如何簡化步驟以實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的快速檢測就成為免疫PCR 發(fā)展的重要探索方向[10]。鄧明俊[8]建立了4種免疫PCR檢測技術(shù),分別以H5亞型禽流感病毒和H5亞型血凝素蛋白為對象進行檢測,研究結(jié)果顯示它可以對活H5N1和H5亞型血凝素蛋白直接、大批量的檢測。

4實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR技術(shù)(real- time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,real-time FQ～PCR)是分子生物學(xué)研究的重要工具,具有操作簡便、快速高效、高敏感性、特異性、可重復(fù)性和定量濃度范圍大等優(yōu)點,且具有定量分析、定性分析以及多重擴增等功能,靈敏度要高于常規(guī)的PCR技術(shù),目前被廣泛運用于新型農(nóng)業(yè)、分子診斷、動植物檢疫、國防軍事和食品安全檢測等領(lǐng)域。

傳統(tǒng)的野生動物疫源疫病檢測方法依賴于癥狀觀察、病毒培養(yǎng)或菌落培養(yǎng)等技術(shù),近年來實時熒光定量PCR憑借其獨特的優(yōu)越性,被廣泛應(yīng)用于禽流感等病毒的檢測。如劉婷婷[2]等通過設(shè)計篩選TapMan探針和引物,優(yōu)化引物和探針的配比濃度,建立了一種可以同時檢測H3和H4亞型禽流感病毒的雙重實時熒光定量RT-PCR方法,能夠快速有效檢測H3和H4亞型禽流感病毒的病原含量。羅寶正[3]等為快速高效檢測H7N9亞型禽流感病毒,建立了多重?zé)晒釸T-PCR方法,該方法通過設(shè)計兩套特異性的引物和探針,能夠快速、痕量、精確的檢測H7N9亞型禽流感病毒,既不會對H7造成漏檢,也可以檢測判斷是否為新型N9亞型病毒。謝芝勛等建立二重?zé)晒舛縍T-PCR方法,設(shè)計了禽流感和新城疫病毒的檢測方法。

5結(jié)語

目前實時熒光定量PCR技術(shù)憑借其快速、高靈敏度、高特異性、定性分析和定量分析等優(yōu)勢,在禽流感病毒和新城疫病毒的檢測方面被廣泛應(yīng)用,為我國野生動物疫源疫病檢測爭取了寶貴的快速反應(yīng)時間,采取必要措施切斷疫病的傳播,防治交叉感染,對保護野生動物資源有著重要的意義。

[1] 胡貞.PCR技術(shù)及其在禽流感診斷中的應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2015,31(8):64,16.

[2] 劉婷婷,謝芝勛,宋德貴,等.H3和H4亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J].中國家禽,2015,37(7):20～24.

[3] 羅寶正,莫秋華,李儒曙,等.新型H7N9亞型禽流感病毒多重?zé)晒釸T-PCR快速檢測方法的建立[J].病毒學(xué)報,2014,30(1):1～5.

[4] 張應(yīng)國,宋建領(lǐng),胡媛媛,等.禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR檢測技術(shù)的建立[J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(8):600～604.

[5] 周建紅,梅小偉,馬濤,等.RT-PCR技術(shù)在診斷H5亞型禽流感病毒中的應(yīng)用[J].湖北畜牧獸醫(yī),2015,36(7):11～12.

[6] 陳明潔,方倜,柯濤,等.多重PCR一種高效快速的分子生物學(xué)技術(shù)[J].武漢理工大學(xué)學(xué)報,2005,27(10):33～36.

[7] 劉婧君.野鴨禽流感病毒和新城疫病毒雙重RT-PCR檢測及禽流感病毒的部分序列分析[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[8] 鄧明俊.免疫PCR檢測低含量H5N1禽流感病毒方法的建立及初步應(yīng)用[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2010.

[9] 劉婷婷,謝芝勛,宋德貴,等.H3N2 亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測方法的建立[J].獸醫(yī)科學(xué),2015(7):172～174.

[10] 黃明,肖笑,徐晟,等.免疫PCR 檢測技術(shù)及其在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,33 (6):119～124.

中圖分類號：S853

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-9944(2016)01-0065-02

作者簡介：王軻(1989—)，男，山東聊城人,助理農(nóng)藝師,主要從事野生動物保護工作。

收稿日期：2015-11-19