嗜血支原體感染東方香豬動(dòng)物模型的建立

樸光一王曉明李華崔成哲金一

（1，延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院 133002；2，延邊華龍集團(tuán) 133002；3，延邊大學(xué) 133400)

嗜血支原體感染東方香豬動(dòng)物模型的建立

樸光一1王曉明1李華2崔成哲1金一3*

（1，延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院 133002；2，延邊華龍集團(tuán) 133002；3，延邊大學(xué) 133400)

豬嗜血支原體也被稱為豬附紅細(xì)胞體，是寄生在豬血液內(nèi)，主要存在于紅細(xì)胞表面或游離于血漿及骨髓中而引起動(dòng)物發(fā)病，發(fā)病仔豬主要以體溫升高、發(fā)生貧血、黃疸及母豬流產(chǎn)等癥狀為特征。本實(shí)驗(yàn)研究以延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的東方香豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)注射地塞米松的方法降低其免疫力，然后以腹腔注射方式接種豬嗜血支原體，以建立嗜血支原體感染東方香豬的動(dòng)物模型。

東方香豬；嗜血支原體；動(dòng)物模型

東方香豬頭形似鼠，四肢細(xì)短，黑背白肚，體重多數(shù)不足10kg，原產(chǎn)海南省的五指山豬，體形小，肉質(zhì)細(xì)嫩、香味濃，是國(guó)際上珍稀的豬種之一。一些研究表明，東方香豬對(duì)豬巴氏桿菌、仔豬副傷寒等細(xì)菌病毒敏感性強(qiáng)，可用作復(fù)制動(dòng)物模型，并在皮膚燒傷、移植，牙齒、口腔疾病模型，心血管模型等方面有所應(yīng)用。豬嗜血支原體也被稱為豬附紅細(xì)胞體[1]，發(fā)病仔豬主要以體溫升高、發(fā)生貧血、黃疸及母豬流產(chǎn)等癥狀為特征。因?yàn)闁|方香豬容易感染豬嗜血支原體且癥狀明顯，適合作為嗜血支原體的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

成年?yáng)|方香豬10頭，其中雄性4頭，雌性4頭，妊娠母豬2頭。按不同年齡、不同性別無(wú)菌采集東方香豬抗凝血50份。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

健康東方香豬10頭，經(jīng)鮮血壓滴標(biāo)本和血液涂片，姬姆薩氏染色鏡檢及PCR方法檢測(cè)確定無(wú)豬嗜血支原體感染后，分為A、B、C、D、E5組，每組2頭，A、B、C3組試驗(yàn)豬用免疫抑制劑處理，方法是注射地塞米松，劑量為每頭香豬每次注射地塞米松10mg，隔日注射1次，一直注射至試驗(yàn)結(jié)束。D組不注射地塞米松，但是感染組。E組不做處理。

1.2.2 豬嗜血支原體陽(yáng)性血液的采集與鑒定

血液樣本壓片鏡檢與染色，甲醇固定，按常規(guī)姬姆薩氏染色后鏡檢。判定標(biāo)準(zhǔn)用PCR檢測(cè)方法，血液標(biāo)本PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠成像儀觀察，若在541bp處得到單一的DNA條帶且條帶清晰明亮者為陽(yáng)性，無(wú)特異性條帶者為陰性。血液壓滴標(biāo)本鏡檢法，將每1份豬的血液壓滴標(biāo)本置于高倍鏡下，觀察20個(gè)視野，觀察到嗜血支原體者為陽(yáng)性，無(wú)嗜血支原體者為陰性；

1.2.3 人工感染試驗(yàn)

用已經(jīng)計(jì)算嗜血支原體感染個(gè)數(shù)的陽(yáng)性豬紅細(xì)胞作為感染香豬的標(biāo)準(zhǔn)樣品，感染方法注射地塞米松腹腔10.0ml/頭。

1.2.4 臨床癥狀觀察

東方香豬在感染嗜血支原體陽(yáng)性豬紅細(xì)胞后，每天早9：00和下午4：00觀察體溫、呼吸、心率變化情況臨床表現(xiàn)并做好記錄。

1.2.5 香豬血液學(xué)檢查

感染后每天分別從各組香豬耳靜脈采血進(jìn)行血液壓滴鏡檢和血液涂片染色鏡檢，連續(xù)觀察嗜血支原體的感染情況。

1.2.6 香豬血液樣本的PCR擴(kuò)增

以感染陽(yáng)性豬紅細(xì)胞作為0d，感染后第1天到第7天，每天分別從各組中的每頭香豬采血，從第7天以后，改為每隔2d采血1次，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.7 香豬血清中豬嗜血支原體抗體檢測(cè)

以感染陽(yáng)性豬紅細(xì)胞當(dāng)天0d，在感染后的第7、14、21、28、35天，分別從無(wú)菌采香豬血液約2ml，靜止離心保存-20℃冰箱中。用ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 東方香豬群嗜血支原體感染情況

應(yīng)用血液壓滴標(biāo)本鏡檢法、血液涂片染色法和PCR方法對(duì)50頭份東方香豬血液樣本進(jìn)行豬嗜血支原體感染情況檢測(cè)，具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，血液壓滴標(biāo)本鏡檢法與PCR檢測(cè)方法檢測(cè)的陽(yáng)性率差異顯著 （0.01＜P＜0.05）。

表1 香豬嗜血支原體感染情況

由表2可見(jiàn)，各年齡段的豬均可感染嗜血支原體，但幼齡豬的易感性高于成年豬，其中1～5月齡的陽(yáng)性率為72.7%，6～12月齡的陽(yáng)性率為71.4%，12月齡以上的陽(yáng)性率為63.6%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同年齡段之間豬嗜血支原體的感染率差異不顯著 （P＞0.05）。

表2 PCR方法檢測(cè)不同年齡香豬嗜血支原體感染情況

2.2 試驗(yàn)組香豬感染前檢查

2.2.1 血液壓滴標(biāo)本檢查

經(jīng)對(duì)感染前香豬進(jìn)行血液壓滴標(biāo)本檢查，可見(jiàn)紅細(xì)胞呈正常形態(tài)。

2.2.2 姬姆薩氏染色檢查

經(jīng)對(duì)感染前香豬血液進(jìn)行姬姆薩氏染色鏡檢，香豬紅細(xì)胞呈正常形態(tài)。

2.3 豬嗜血支原體陽(yáng)性血液的鑒定

姬姆薩氏染色方法，被檢豬血液涂片，姬姆薩氏染色，油鏡觀察，可見(jiàn)嗜血支原體被染成淡紫色。

2.4 感染后東方香豬的臨床癥狀

感染豬嗜血支原體14d左右，A、B、C、D組東方香豬相繼表現(xiàn)出體表及可視黏膜蒼白，高熱達(dá)到42℃，厭食、反應(yīng)遲鈍、消化不良等癥狀，個(gè)別豬黃疽，四肢特別是耳尖邊緣發(fā)紺。耳朵、頸下、胸前、腹下、四肢內(nèi)側(cè)等部位皮膚紅紫。出現(xiàn)便秘或拉稀，有時(shí)便秘和拉稀交替出現(xiàn)。個(gè)別豬后肢發(fā)生麻痹，不能站立，臥地不起。體溫、呼吸、心率變化見(jiàn)表3。E組東方香豬表現(xiàn)正常。

2.5 感染后香豬血液學(xué)檢查

2.5.1 血液壓滴方法檢查

香豬人工感染嗜血支原體后的第3～5天，經(jīng)血液壓滴標(biāo)本檢查，可見(jiàn)紅細(xì)胞有嗜血支原體感染，其形態(tài)、大小與豬嗜血支原體相同。A、B、C3組試驗(yàn)香豬在感染后的第5～7天紅細(xì)胞感染率達(dá)到80%，第9～12天紅細(xì)胞感染率相繼達(dá)到90%以上，第14天后感染率下降，但一直維持在75%左右；D組東方香豬嗜血支原體呈一過(guò)性感染；E組東方香豬無(wú)變化。

表3 嗜血支原體感染仔豬體溫、呼吸、心率變化情況（平均值）

2.5.2 姬姆薩氏染色檢查

試驗(yàn)組香豬血液涂片，姬姆薩氏染色，油鏡觀察，可見(jiàn)嗜血支原體被染成淡紫色。

2.5.3 血常規(guī)檢查

感染后第7天采集各組香豬血液做血液常規(guī)測(cè)定，并應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4表明，各組東方香豬在感染豬嗜血支原體后，白細(xì)胞總數(shù)顯著升高 （P＜0.01），淋巴細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量均顯著下降 （P＜0.05），紅細(xì)胞比容顯著下降 （P＜0.01）。

2.6 東方香豬血清中豬嗜血支原體抗體的檢測(cè)

將濃度為5μg/ml的豬嗜血支原體提純抗原包被于酶標(biāo)板，待檢血清稀釋倍數(shù)為1：100，酶標(biāo)二抗作濃度稀釋倍數(shù)為 1：4000，判定標(biāo)準(zhǔn)血清 OD405值≥0.18定為陽(yáng)性，OD405值≤0.14定為陰性，0.14～0.18之間定為疑似。在感染后的第3、5、7、14、21天，采集每組東方香豬的血清，在上述條件下進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5。

從圖中可以看出，A、B、C3組東方香豬的抗體水平在感染第7天時(shí)達(dá)最高，D組香豬的抗體水平從3d開(kāi)始直到21d時(shí)一直在升高。說(shuō)明低免疫力影響東方香豬的抗體水平升高。

表5 東方香豬血清間接ELISA檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

（1）東方香豬可感染嗜血支原體，其感染率達(dá)70%。低免疫力的香豬在人工感染豬嗜血支原體后相繼表現(xiàn)出體溫升高，精神萎頓，食欲減退；可視黏膜蒼白、黃染，個(gè)別豬全身皮膚黃染；兩耳發(fā)紺，耳尖干燥。四肢內(nèi)側(cè)、胸腹下有大小不同的出血點(diǎn)和紫斑；有不同程度的嘔吐、腹瀉，消瘦，生長(zhǎng)發(fā)育遲滯；體溫、呼吸、心率均有明顯變化，出現(xiàn)了豬嗜血支原體病典型臨床癥狀。

表4 試驗(yàn)組東方香豬感染前后血液常規(guī)比較

（2）成功建立了嗜血支原體東方香豬動(dòng)物感染模型。合適的感染劑量對(duì)動(dòng)物模型建立非常重要，劑量小可能達(dá)不到所要求的感染率，而劑量太大則可能造成試驗(yàn)動(dòng)物死亡，因此感染劑量的多少直接影響到模型建立是否成功。

樸光一 （1966-)，男，高級(jí)畜牧師，研究方向：病原和分子生物學(xué)。

*通訊作者：金一，教授，主要從事分子生物學(xué)研究。