山西省豬胸膜肺炎放線桿菌分離及藥敏實驗

雷宇平 張仲萍 羅甜甜 （山西省動物疫病預防控制中心 030027)

山西省豬胸膜肺炎放線桿菌分離及藥敏實驗

雷宇平 張仲萍 羅甜甜 （山西省動物疫病預防控制中心 030027)

為了解山西省胸膜肺炎放線桿菌的流行分布及耐藥情況，以確定有效的防控措施和用藥計劃，從山西省20個豬場采集疑似豬傳染性胸膜肺炎的病料組織，經分離培養、生化鑒定、PCR檢測和藥敏實驗。確定3株分離株為豬胸膜肺炎放線桿菌。藥敏實驗結果表明，3株菌對頭孢克肟、氟苯尼考和氨芐西林最為敏感；對阿莫西林、恩諾沙星、環丙沙星等7種抗菌藥物為中敏；而對鏈霉素、慶大霉素、強力霉素、四環素和氯霉素表現出耐藥性。

胸膜肺炎放線桿菌；分離鑒定；PCR檢測；耐藥性

胸膜肺炎放線桿菌 （Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，是革蘭氏陰性桿菌，有很強的致病性，能夠引起豬傳染性胸膜肺炎。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌可以經消化道和呼吸道感染各年齡段的豬群[1]，最常見的病理變化是肺臟出血、壞死和纖維素性滲出。急性感染的豬死亡率高，慢性感染的豬生長緩慢、飼料報酬低[2]。該病在我國的發生率逐年上升，已經嚴重危害到我國養豬業的發展[3-5]。APP血清型有15種[6]，地域分布廣，再加上長期不合理地使用抗菌藥物使其產生耐藥性，導致該病的診斷和防控工作異常艱巨。為了解山西省APP的流行分布及耐藥情況，以確定有效的防控措施和用藥計劃，本研究于2014年對山西省11個地區的20個豬場進行了調查。

1 材料與方法

1.1 病料

2014年1月至12月，從山西省11個地區豬場采集病死豬的肺臟、肝臟、心臟、脾臟等病變組織。

1.2 培養基和試劑

營養瓊脂培養基、麥康凱培養基購于國藥集團化學試劑有限公司；微量生化管、藥敏紙片購于杭州天和微生物試劑有限公司；Premix Taq，DL2000 DNA Marker ladder購于寶生物工程 （大連）有限公司。

1.3 細菌分離培養

無菌取病料，用接種環在血平板上劃線，置于10%CO2，37℃培養24h，將疑似菌落接種到麥康凱培養基上。

1.4 生化試驗

將純化的細菌接種到微量生化管中，置于10%CO2，37℃培養24～48h，觀察結果。

1.5 藥敏試驗

采用K-B藥敏紙片法，將純化的菌落均勻涂布于瓊脂平板上，將藥敏紙片貼于培養基表面，37℃培養12～16h，觀察結果，并依據藥敏試驗抑菌環直徑判斷標準來判定試驗結果。

1.6 致病性試驗

將分離獲得的菌株活化后接種于5% （v/v）的綿羊血瓊脂培養基中，37℃培養18～24h后，稀釋菌液，使其濃度為3×1010cfu/ml。取80只40日齡的豬，隨機分成試驗組1（菌株1），試驗組2（菌株2），試驗組3（菌株3）和對照組，每組20只，試驗組各豬予肌肉注射3ml各分離菌株，對照組各豬肌肉注射等體積滅菌生理鹽水。觀察發病和死亡情況、剖檢變化，并進行細菌分離。

1.7 PCR檢測

根據Alain[7]等的方法，設計并合成一對針對APP保守序列APXIV的特異性引物：上游：5'-TGGCACTGACGGTGATGA-3'，下游：5'-GGCCATCGACTCAACCAT-3'，對分離株進行PCR檢測。用DNA提取試劑盒制備分離株的基因組DNA作為PCR擴增的模板，加入酶、引物和ddH2O后，按照以下程序進行擴增：94℃預變性5min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，30個循環，72℃后延伸10min。取5μL PCR產物，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

2 結果

2.1 細菌分離培養特征

該菌在10%CO2，37℃培養條件下生長良好，24h形成1～2mm濕潤、半透明、邊緣整齊的菌落。經革蘭氏染色，鏡檢為陰性小桿菌，菌體平直，單個或雙個存在。

2.2 生化實驗

3株分離株生化鑒定結果完全相同 （表1），葡萄糖、甘露糖、果糖、麥芽糖、VP試驗、尿素酶、氧化酶、透明質酸酶和過氧化氫酶實驗均為陽性；甘露醇、山梨醇和MR實驗為陰性。

表1 菌株的生化鑒定結果

2.3 PCR鑒定

對菌株進行PCR檢測，擴增出422bp的片段 （附圖），說明該菌株為胸膜肺炎放線桿菌。

附圖 PCR檢測結果

2.4 致病性試驗

40日齡試驗豬感染后，各實驗組第2天豬群開始發病，試驗組1有13只發病，試驗組2有15只發病，試驗組3有14只發病，第3天各試驗組試驗豬均發病并出現臨床癥狀，主要癥狀為精神沉郁，高溫，呼吸困難。第4天出現死亡高峰，剖檢可見纖維素性胸膜炎非常明顯，嚴重的發現肺實質黏附在胸膜壁上。取病死豬的肺部進行細菌分離鑒定，其生化特性與接種菌一致。

2.5 藥敏試驗

由表2可見，3株菌對頭孢克肟、氟苯尼考和氨芐西林最為敏感；對阿莫西林、恩諾沙星、環丙沙星等7種抗菌藥物為中敏；對鏈霉素、慶大霉素、強力霉素、四環素和氯霉素表現出耐藥。

表2 分離豬傳染性胸膜放線桿菌藥敏試驗

3 討論

目前，實驗室常用的APP診斷方法有血清學試驗包括間接凝集試驗、補體結合反應、玻片凝集試驗、乳膠凝集試驗、瓊脂擴散試驗和ELISA等方法。由于APP有很多血清型，各血清型之間沒有很好的交叉反應[8]，從而會影響血清學試驗的準確性。而細菌分離培養、生化試驗等方法費時費力。因此，建立一種方便快捷并且靈敏度高的診斷方法非常必要。

根據瑞士Alain Schaller[7]報道，以App所有血清型菌株做模板，用PCR方法都能擴增出APX IVA基因片段，而從其他親緣關系相近的細菌中無法擴增這一片段，說明APX IVA基因具有很高的種特異性。因此本研究參照Alain的方法，對3株分離株進行PCR鑒定。結果顯示，3株分離株均為胸膜肺炎放線桿菌。在此基礎上，本研究繼續對這3株APP進行常用抗菌藥物敏感性試驗。結果顯示3株胸膜肺炎放線桿菌對鏈霉素、慶大霉素、強力霉素、四環素和氯霉素表現出耐藥性且都表現出多重耐藥，這與國內其他地區的報道[9-11]存在一定差異。究其原因可能是各地區使用的抗菌藥物種類和用藥時間有差異，也可能與細菌的血清型不同有關。

本研究通過對山西省11個地區20個豬場采集病料組織，經過細菌分離培養、生化培養和PCR鑒定，獲得3株胸膜肺炎放線桿菌。對3株分離株進行藥物敏感性試驗測定，結果顯示對鏈霉素、慶大霉素、強力霉素、四環素和氯霉素表現出耐藥性。本研究為山西地區豬場防控APP，指導臨床合理使用抗菌藥物提供了科學依據。

[1]蔡寶祥.家畜傳染病[M].2版.北京:中國農業出版社,1996.

[2]Savaeye C,Jobert,J L,Berthelot herault F,et al.A PCR assay used to study aerosol transmission of actionobacillus pleuropneumoniae from samples of live pigs under experimental conditions[J].Veterinary Microbiology,2000,73:337-347.

[3]陳如明,謝鳴星,李云峰,等.魯豫地區駐軍豬傳染性胸膜肺炎血清學調查[J].中國畜禽傳染病,1990(4):38-40.

[4]鄔捷,姜永康,曹國文,等.四川豬嗜血桿菌胸膜肺炎血清學調查[J].動物檢疫,1990(6):21-22.

[5]華云龍,張應國,鐘南.云南豬傳染性胸膜肺炎血清抗體調查[J].動物檢疫,1992,9(3):27.

[7]SchallerA,Kuhn R,KuhnertP,et al.Characterization of apxIVA,a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae[J].Microbiology,1999,145(Pt 8):2105-2116.

[8]Freddy Haesebrouck,Anita Van de Kerkhof.Cross protection between Actionbacillus pleuropneumoniaes biotypes serotpes in pigs[J].Veterinary Microbiology,1996,52(3-4):277-284.

[9]何啟蓋,王貴平,劉軍發,等.豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國預防獸醫學報,2003,25(5):360-363.

[10]李曉華,楊小燕.豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定[J].中國獸醫科技,2003,33(3):49-51.

[11]周信榮,宋德平,彭棋,等.豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定、毒力基因檢測及藥敏試驗[J].2016,37(1):67-71.

山西省科技攻關項目；項目名稱：豬工廠化健康養豬精準技術體系研究——豬呼吸系統主要細菌病綜合防控技術研究；項目編號：20140311020—6。