LAMP研究中的常見問題分析及解決方法

楊卓

（1.遼寧省大連市動物疫病預防控制中心，遼寧 大連 116037；2.遼寧省大連市畜牧總站，遼寧 大連 116037）

LAMP研究中的常見問題分析及解決方法

楊卓1，2

（1.遼寧省大連市動物疫病預防控制中心，遼寧 大連 116037；2.遼寧省大連市畜牧總站，遼寧 大連 116037）

本文通過《小反芻獸疫病毒RT-LAMP快速檢測和鑒別方法的建立》研究中的相關擴增曲線和試驗結論，對LAMP研究中出現的幾種問題進行了初步探討，并提出解決方案。文章從氣溶膠污染、非特異性擴增、擴增效率不高和擴增曲線常見問題分析等方面，分析其產生原因并總結了相關解決辦法，從而為今后的LAMP技術研究和推廣做出貢獻。

LAMP技術；氣溶膠污染；非特異性擴增；擴增效率不高；擴增曲線

環介導恒溫核酸擴增技術（l oop-m edi ated i sotherm al am pl i fi cati on of DN A，LAM P）是由N otom i等于2000年發明的一種恒溫、快速、高特異性和操作簡便的分子生物學檢測技術。其反應原理是：根據序列保守區域設計的一對外引物、一對內引物和一對環引物特異性識別靶序列上的六個獨立區域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，60～65℃范圍60 m i n內，大量合成目標DN A，同時伴隨有副產物白色的焦磷酸鎂沉淀產生[1]。LAM P技術以其自身的優勢，在國際上已成為了分子生物學檢測技術的研究熱點，也被應用于多種疾病的檢測，例如小反芻獸疫病毒[2]、日本腦炎病毒[3]、口蹄疫病毒[4]、H 5N 1禽流感病毒[5]和結核分枝桿菌[6]等。

對于LAM P反應的結果判定，目前有四種方式：眼觀白色沉淀檢測法（簡稱“目測法”）、熒光指示劑法、傳統的瓊脂糖凝膠電泳檢測和濁度儀的實時濁度法。前兩種方法僅通過肉眼判定，誤差較大，不適用于科學研究；第三種方法無法判定反應中是否出現污染、二聚體擴增等假陽性情況，從而得不到準確、高效的反應體系；而利用濁度儀，采用實時濁度法，能夠使整個反應都在密閉條件下進行，從而最大程度地避免污染，并且能夠實時監測反應過程中所產生的白色焦磷酸鎂沉淀，并繪制成擴增曲線。通過對曲線形態的分析，能夠客觀準確的排除假陽性結果；通過沉淀產生的起始時間判斷反應的進行程度；通過濁度值的高低和反應開始時間的快慢來優化、最后確定最佳反應體系[7]。因此，實時濁度法成為了LAM P研究中，確定和分析反應結果的主流方法。筆者以在LAM P研究中幾種常見問題為例，對其產生的原因進行分析并提出相應的解決方法，從而促進LAM P法的推廣和更深層次的研究。

1 試驗儀器

濁度儀，型號為La-320C，La-500。

2 試驗試劑

核酸提取試劑盒，購自Invi trogen公司；LAM P法RN A擴增試劑盒（RN A Am pl i fi cati on Ki t），購自日本榮研化學株式會社；LAM P反應管（Reacti on Tube），購自日本榮研化學株式會社。

3 擴增曲線來源

《小反芻獸疫病毒RT-LAM P快速檢測和鑒別方法的建立》研究中的相關擴增曲線。

4 試驗中的常見問題

4.1氣溶膠污染根據LAM P反應可知，其反應過程可對靶序列的4～6個區域進行擴增，反應產物可達到PCR反應的102～103倍，反應過程中極易產生氣溶膠污染，是LAM P研究中應首要避免的因素之一。其解決方法：①嚴格核酸提取和擴增進行分區；②反應全程禁止開啟反應管。

4.2非特異性擴增由于LAM P反應對靶序列的擴增區域較多，因此與PCR技術相比較容易出現非特異性擴增的現象。除了技術本身的特點以外，導致LAM P反應出現非特異性擴增的因素還有很多，例如M g2+的濃度、引物特異性欠佳、反應溫度等。解決此類問題的方法：①在設計引物時要尋找高保守特有序列；②引物設計完成后應利用O l i go等分子生物學分析軟件對其進行二聚體情況分析；③在試驗研究中最好采用特定的LAM P研究試劑盒，或者進行M g2+濃度的篩選試驗，以確定反應的最佳環境；④需要進行最佳反應溫度篩選試驗。通過以上方法，尋找出最佳反應體系，從而最大限度地避免非特異性擴增的產生。

4.3擴增效率不高筆者試驗中積累得出以下經驗：通常LAM P反應在開始后10～20 m i n便可出現濁度的變化，即擴增反應開始；若在反應25 m i n后才出現擴增，則該體系不是最佳的反應體系，應及時查找原因進行優化。在優化體系過程中應首先排除體系污染、非特異性擴增、引物質量欠佳等情況。若仍不能解決，應考慮引物比例是否得當。通常引物的常用比例為FIP（BIP）：LF（LB）:F3（B3）=8:4:1，但對于不同靶序列，該比例組合未必最佳，因此需重新探索引物比例。

4.4擴增曲線中的常見問題分析

圖1 正常擴增曲線Fig.1Normal amplification curve

4.4.1正常擴增曲線圖片來自La-320C型濁度儀。在利用濁度儀進行的LAM P研究中，可同時繪制出反應的擴增曲線和速率曲線，擴增曲線代表焦磷酸鎂的沉淀量，以濁度值表示，用于判定反應結果；速率曲線代表反應效率，在分析檢測結果時起到輔助作用。正常的擴增曲線和速率曲線如圖1和圖2。由圖1可見，反應初期迅速產生大量焦磷酸鎂沉淀，反應體系濁度迅速上升，隨后沉淀產生速度變慢，曲線變化趨于緩和；同時圖2與圖1相互印證，即初期反應速率較高，到達峰值之后速率逐漸下降至末期趨于反應平衡狀態。

圖2 正常速率曲線Fig.2Normal judgment curve

圖3 擴增曲線Fig.3Amplification curve

圖4 速率曲線Fig.4Judgment curve

4.4.2異常擴增曲線

4.4.2.1核酸濃度過高圖片來自La-500型濁度儀。如圖3擴增曲線所示，CH 6反應孔（稱之為“樣本A”）的濁度值呈直線上升；圖4速率曲線在反應初期迅速上升并迅速下降至負值，且無反應平衡期。此種情況為樣本核酸濃度過高，解決方法為：將樣本進行梯度稀釋后再次進行擴增。

4.4.2.2引物擴增速率過快圖片來自La-320C型濁度儀。如圖5擴增曲線所示，CH 1（稱之為“樣本B”）和CH 4（稱之為“樣本C”）反應孔反應開始后，濁度值僅有微小上升，便迅速下降且降至基準線以下。從圖6速率曲線所示，反應開始后不久便達到反應平衡狀態。結合兩種圖像分析，出現此種情況的原因為：體系的反應速率過快。濁度儀默認的濁度監測開始時間為反應進行10 m i n后，若反應速率過快，濁度儀開始進行監測前反應體系便已經生成大量沉淀并累積在試管底部，從而使濁度儀繪制的反應曲線不準確，由此出現圖5所示情況。解決方法：①將濁度儀O pti ons選項中Ignore（Bef.）Ti選項設定的濁度監測起始時間縮短；②對將樣本進行梯度稀釋。

4.4.3進行相關調整后的反應曲線根據提供的相關解決方案：①將A樣本進行10倍稀釋；②將B和C樣本進行10倍稀釋的同時，調整濁度儀O pti ons選項中Ignore（Bef.）Ti，使濁度監測時間變更為5 m i n。再次進行擴增反應，得出以下曲線，圖7為擴增曲線，圖8為速率曲線。

圖5 擴增曲線Fig.5Amplification curve

圖6 速率曲線Fig.6Judgment curve

通過試驗證實，以上解決方案均為有效方案，再次對樣本進行擴增后取得了理想的擴增效果。

5 小結

LAM P技術由于具有恒溫、操作簡單、對儀器設備要求低等優點，已被許多行業應用到多種類型的實驗室及臨床檢測中。但由于其擴增產物量巨大、擴增位點較多，也產生了反應體系易污染和非特異性擴增等問題。文章對氣溶膠污染、非特異性擴增、擴增效率不高和擴增曲線常見問題的探討和解決，有利于LAM P技術更廣泛的推廣和應用，從而發揮其更大的價值。

圖7 擴增曲線Fig.7Amplification curve

圖8 速率曲線Fig.8Judgment curve

[1]LI Xue-l i an,LIU W ei,W AN G J i e,et al.Rapi d detecti on ofTri chi nel l a spi ral i sl arvae i n m uscl es by l oop-m edi ated i sotherm alam pl i ficati on[J].IntJParasi tol,2012,42(13-14): 1119-1126.

[2]楊卓，于漢勛，李巍.小反芻獸疫病毒RT-LAM P檢測方法的研究[J].現代畜牧獸醫，2015，7：8-14.

[3]Tori ni w aH,Kom i yaT,Rapi d detecti on and quanti fi cati on ofJ apaneseencephal i ti svirus by real-ti m e reverse transcri pti on l oopm edi ated i sotherm alam pl i fi cati on[J].M i crobi ol Im m unol,2006,50:379-387.

[4]李健，陳沁，熊祎，等.口蹄疫病毒RT-LAM P檢測方法的建立[J].病毒學報，2009，25（2）：137-142.

[5]馬啟明，馬學軍，高寒春，等.逆轉錄環介導等溫核酸擴增技術（RT-LAM P）在H 5N 1禽流感病毒基因檢測中的應用[J].病毒學報，2008，24（3）：178-184.

[6]黃帆，李琳，林世平，等.DN A環介導恒溫擴增技術速檢測結核分枝桿菌的研究[J].現代食品科技，2008，24（8）：835-838.

[7]楊卓，于漢勛，李巍.小反芻獸疫病毒RT-LAM P快速檢測與鑒別方法的建立[J].中國獸醫科學，2015，45（9）：930-936.

Some problems and relevant solutions on LAMP research

Yang Zhuo1,2
(1.DaLi an Center forAni m al Di sease Preventi on and Control,Li aoni ngDal i an116037; 2.DaLi an Ani m al H usbandry Stati on,Li aoni ngDal i an116037)

Thi s arti cl e w as based on the records of Establ i shm ent of RT-LAM P for the detecti on and di fferenti ati on ofpeste des peti ts rum i nants vi rus.Som e probl em s i n the research ofLAM P w ere di scussed,and the sol uti ons w ere put forw ard.A few si tuati ons,such as aerosolpol l uti on, nonspeci fi c am pl i fi cati on,l ow effi ci ency ofam pl i fi cati on,and som e probl em s i n am pl i fi cati on curve had been di scussed deepl y.And thi s arti cl e sum m ari zed the rel evant sol uti ons for the si tuati ons above.Thi s arti cl e had som e contri bute to the research and prom oti on of LAM P technol ogy.

LAM P technol ogy;Aerosol pol l uti on;N onspeci fi c am pl i fi cati on;Low effi ci ency of ampl i fi cati on;Am pl i fi cati on curve

S852.65

B

1672-9692(2016)07-0053-05

2016-06-11

楊卓（1982-），女，大學本科，學士，獸醫師，研究方向：動物疫病診斷及防控。