多殺性巴氏桿菌和豬圓環病毒混合感染的診斷

馬莉莉，王宇婷，趙微，翟軍軍，倪宏波

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

多殺性巴氏桿菌和豬圓環病毒混合感染的診斷

馬莉莉，王宇婷，趙微，翟軍軍，倪宏波?

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

大慶市某豬場發生以高熱稽留、呼吸困難以及食欲廢絕等為臨床癥狀，部分仔豬甚至死亡的疫情。無菌采集病料，提取病變組織DNA或RNA進行豬瘟病毒、圓環病毒的PCR或RT-PCR檢測，同時進行細菌分離培養等試驗。PCR擴增出700 bp的豬圓環病毒特異性條帶。診斷為多殺性巴氏桿菌和豬圓環病毒混合感染。

圓環病毒；巴氏桿菌；混合感染；診斷

豬圓環病毒病（Porci neci rcovi rus di sease）是由豬圓環病毒2型（Porci neci rcovi rus 2，PCV2）導致的患病豬全身性淋巴結腫大為特征的多系統器官功能衰竭的一類疾病的統稱[1]。臨床上的主要表現為斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PM W S）、豬呼吸疾病綜合征（PRDC）、新生仔豬先天震顫（CT）[2]。不同年齡的豬都可感染豬圓環病毒，病豬可通過鼻液、糞便等排泄物排出病毒，經口腔和呼吸道途徑可傳染給健康的豬[3]。豬巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種傳染性疾病，又名豬肺疫，急性病例呈現出血性敗血癥，咽喉部急性腫脹，高度呼吸困難[4]。長途運輸或頻繁遷移、過度疲勞、飼料突變、營養缺乏等也常常誘發此病。2016年4月，黑龍江大慶某豬場發生以生長緩慢、體溫升高、呼吸困難等為主要特征的傳染病，該豬場養仔豬80頭，發病率20%，死亡率6%，于發病后2 d送診，實驗室剖檢后無菌采集病死豬肝臟、肺臟、腎臟和淋巴結等病料，進行病原學檢測。

1 材料與方法

1.1病料的采集無菌采集病死豬的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟和淋巴結等病料，供實驗室診斷用。

1.2試劑M arker DL 2000購自大連寶生物工程有限公司；PCR M aster M i x緩沖液、TIAN am p Genomi c DN A Ki t和RN easy Pl us M i niH andbook RN A購自北京博凌科為生物科技有限公司；RevertAi d Fi rst Strand cDN A Synthesi s Ki t購自賽默飛世爾科技中國有限公司。藥敏紙片包括多粘菌素B、慶大霉素、硫酸頭孢喹肟和鹽酸頭孢噻呋混懸液等購于浙江海正藥業股份有限公司。

1.3引物設計根據GenBank中已發表的豬瘟病毒、圓環病毒、多殺性巴氏桿菌和鏈球菌的基因序列設計特異引物，并送上海生工生物工程技術服務有限公司合成。詳見表1。

1.4細菌分離培養無菌操作采集肝臟和肺臟等病料，接種5%兔血脂培養基和營養瓊脂培養基，置37℃恒溫箱中培養24 h，觀察菌落形態和溶血等情況。挑取疑似菌的單個菌落進行純培養，劃線于鮮血瓊脂培養基，37℃恒溫箱中需氧培養24 h，觀察菌落形態等。

1.5核酸的提取及鑒定

1.5.1組織DNA和RNA提取按照TIAN am p Genom i c DN A Ki t操作進行提取DN A；按照RN easy Pl us M i niH andbook RN A提取盒進行提取RN A，-20℃保存備用。

表1 引物序列Table1Primer sequences

1.5.2RNA反轉錄和PCR擴增按RevertAi d Fi rst Strand cDN A Synthesi s Ki t反轉錄盒說明書操作步驟將病毒提取的RN A進行反轉錄，得到的cDN A在-20℃進行保存備用。用得到的DN A和cDN A為模板，豬瘟病毒、高致病性藍耳病毒、圓環病毒、多殺性巴氏桿菌、鏈球菌等特異性引物進行PCR反應擴增，取5 μL的擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6藥敏試驗將鑒定為多殺性巴氏桿菌的純培養物用接種棒均勻涂布在鮮血培養基上，將藥敏紙片（慶大霉素、卡那霉素、恩諾沙星等10種藥物）分別貼于平皿中，37℃培養24 h，測定抑制菌圈直徑大小，根據檢測標準判定結果。

2 結果與分析

2.1剖檢變化病理變化表現為全身黏膜、漿膜出血，腸管充血，淋巴結水腫；氣管內有泡沫狀樣黏液；肺臟有不同程度的肝變區，間質增寬，整個肺呈纖維素性變化，切面呈大理石樣紋理，淤血呈紫紅色；心肌變性，質地松軟，心包液增多，見圖1和圖2。

2.2革蘭氏染色將病料中所分離的細菌進行純培養，然后對其進行革蘭氏染色、涂片、鏡檢。可見到革蘭氏染色陰性桿菌，染色可見兩極濃染的球桿菌，疑似多殺性巴氏桿菌，見圖3。

圖1 氣管內有泡沫狀黏液Fig.1The trachea with foamy mucus

圖2 肺臟淤血水腫Fig.2Congestion edema of the lungs

圖3 兩極濃染球桿菌（10×10）Fig.3Two levels of dyeing ball coli（10×10）

2.3PPCCRR結果PCR或RT-PCR檢測結果表明，第4孔在700 bp左右有一條清晰的條帶，與圓環病毒預期片段大小相符；第6孔在450 bp左右有一條清晰的條帶，與巴氏桿菌預期片段大小相符，見圖4。

2.4藥敏試驗結果該病原菌對硫酸頭孢喹肟和鹽酸頭孢噻呋高度敏感,對卡那霉素、恩諾沙星、阿米卡星和多粘菌素B敏感，對青霉素、慶大霉素、克拉霉素和阿奇霉素耐藥，詳見表2。

圖4 PCR電泳分析圖Fig.4PCR electrophoresis analysis chart

表2 藥敏結果Table2The results of drug susceptibility

3 討論

3.1豬圓環病毒經常呈現隱性感染，要定期進行檢測，并且淘汰病豬，避免混合感染導致其他的疾病[5]。治療多殺性巴氏桿菌要根據要藥敏結果進行致病菌特性，合理使用抗生素且不可隨意用藥。

3.2飼養管理應加強，周圍環境衛生要處理好，增強家畜的抵抗力非常關鍵[6]。發現病豬最好隔離，創造舒適環境，有利于疾病的康復。建立規模化養豬場防疫管理等制度，實行全進全出，定期對豬群進行監測，圈舍和用進行消毒，病死豬進行深埋處理，豬舍凈化[7]。保育豬轉舍，育肥豬出欄后，要最少空舍2周，2周內至少要消毒2次以及體外凈化等[8]。

3.3用商品化疫苗對母豬進行免疫[9]，做好各種疾病的預防接種，免疫母豬使得仔豬能從初乳中獲得母源的抗體保護，能夠在5周內有效避免PCV2的感染[10]。更應該注意飼養的密度，減少不良因素的應激，可減少疾病的發生。

3.4本次該豬場發病在臨床診斷的基礎上，采用病原的分離鑒定和PCR鑒定，診斷為多殺性巴氏桿菌和豬圓環病毒混合感染，根據藥敏試驗結果推薦使用硫酸頭孢喹肟進行治療。

[1]郎洪武，王力，張廣川，等.豬圓環病毒病及生物制品學的研究進展[J].中國獸醫科學，2012，42（5）：545-550.

[2]宋長緒，梁鵬帥.豬圓環病毒研究進展[J].廣東農業科學，2010（9）：34-37.

[3]Stevenson GM,Ki upel M,M i ttal SK.Ti ssue di stri buti onandgeneti ctypi ngofporci ne ci rcovi rusi n pi gsw i th natural l yoccurri ng congeni taltrem ors[J].VetDi agnInvest, 2001,13(1):57-62.

[4]甘孟候，楊漢春.中國豬病學[M].北京：中國農業出版社，2005：177-182.

[5]朱鳳瓊，孟志宏，陳少美.豬多殺性巴氏桿菌病的診治[J].云南畜牧獸醫，2004（2）：43.

[6]楊家飛.豬瘟和豬肺疫的混合感染診治[J].貴州畜牧獸醫，2013（3）：42-43.

[7]梁曉芹，宋永閣.豬肺疫的臨床及綜合防制[J].農村實用科技信息，2009（4）：38.

[8]丁明彬，王光芳，王紅霞，等.豬肺疫的防制[J].中國畜牧獸醫，2009，36（2）：118-119.

[9]Burch D.Ci rovi rus now for the good new s[J]. Pi gs i nternati onal,2007(5):15-17.

[10]張文奎.豬肺疫的診斷與防制[J].山東畜牧獸醫，2013（3）：21-22.

Diagnosis of the combined infection with Circovirus and Pasteurella of swine

M a Li l i,W ang Yuti ng,Zhao W ei,Zhai J unj un,N i H ongbo*
(Col l ege of ani m al sci ence and technol ogy,H ei l ongj i ang Bayi Agri cul tural Uni versi ty,H ei l ongj i angDaqi ng 163319)

A pi g farmw i th fever,di ffi cul ty breathi ng and l oss of appeti te as the cl i ni cal sym ptom s i n the ci ty ofDaqi ng,som e pi gs even death.Col l ected asepti cal l y di seased ti ssue extract DN A or RN A for PCR or RT-PCR detecti ng ci rcovi rus and sw i ne fever vi rus,w hi l e for bacteri al i sol ati on tests.PCR am pl i fi ed 700 bp porci ne ci rcovi rus speci fi c bands.By l aboratory di agnosi s a pi g farmpi gs di ed,the eti ol ogy of the di sease i s di agnosed w i th Pasteurel l a and Ci rcovi rus combi ned i nfecti on.

Ci rcovi rus;Pasteurel l a;Com bi ned i nfecti on;Di agnosi s

S858.28

B

1672-9692(2016)07-0036-04

2016-05-18

馬莉莉（1992-），女，黑龍江人，在讀碩士，研究方向為分子細菌學和免疫學。

倪宏波（1972-），男，黑龍江人，教授，博士生導師，主要從事分子細菌學和免疫學研究。

博士科研啟動基金（編號：LBH-Q 14134）。