牛病毒性腹瀉病毒的分離與鑒定

畢瑩，倪宏波

（黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163319）

牛病毒性腹瀉病毒的分離與鑒定

畢瑩，倪宏波?

（黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163319）

為了對牛病毒性腹瀉病毒進行分離鑒定，本試驗通過對黑龍江省完達山牛場疑似感染牛病毒性腹瀉病毒患牛的直腸糞便以及鼻拭子進行無菌采集，樣品經常規處理后接種于MDBK細胞，盲傳3次以及PCR擴增鑒定，最后對收集到的病毒進行蝕斑純化試驗。結果表明，病毒MDBK細胞出現明顯病變，PCR鑒定與預期結果相符，3次蝕斑純化后分離到該病毒。結論可成功分離到牛病毒性腹瀉病毒。

牛病毒性腹瀉病毒；MDBK；鑒定；蝕斑純化

牛病毒性腹瀉病（Bovi ne vi raldi arrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovi ne vi raldi arrhea vi rus，BVDV）引起的傳染病，各種年齡的牛都易感染，以犢牛易感性最高。BVDV是黃病毒科瘟病毒屬成員[1]，單股RN A、有囊膜的病毒?；蚪M全長12.5 kb，其開放閱讀框共編碼4種結構蛋白和8種非結構蛋白[2-3]。BVDV根據基因組5'-UTR序列，分為BVDV-1和BVDV-2型，其中BVDV-1有很多亞型，目前已分出18種亞型1a-1t，BVDV-2分為4個亞型2a～2d[4]。其中BVDV-1型呈全球性廣泛分布，BVDV-2型僅有部分國家流行[5]。國外最早是在1946年發現BVDV，而我國在1980年成功分離并鑒定BVDV，并在我國20多個省市都報道了該病[6]。根據是否發生細胞病變，可分為兩種生物型，即致細胞病變型（cytopathogeni c，CP）和非致細胞病變型（noncytopathogeni c，N CP）。BVDV的流行給國內外養牛業的發展帶來很大損失，BVDV可引起呼吸綜合征、先天性缺陷、免疫抑制、繁殖障礙、腸炎、母畜流產等癥狀[7]。本試驗通過采集臨床疑似牛病料，處理后接種于M DBK細胞進行盲傳，提取病毒RN A，通過PCR擴增鑒定為BVDV1b型，并采用蝕斑純化分離病毒。

1 材料與方法

1.1引物設計采用O l i go7軟件在5’UTR保守區設計1對引物，由哈爾濱博仕生物有限公司合成。引物序列如下：上游引物：5’-ATGCCCTATAGTAGGACTAGCA-3’；下游引物：5’-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3’。

1.2方法

1.2.1細胞培養與病毒的分離鑒定將M DBK細胞用PBS緩沖液沖洗3次，0.25%濃度胰酶消化，置于37℃CO2培養箱中消化3～5 m i n，棄掉胰酶，加入培養液（5%血清，1%雙抗DM EM），反復吹吸細胞，使細胞分散，鏡下觀察，置于37℃CO2培養箱培養。

將采集的3頭牛的糞便以及鼻拭子進行處理，糞便用PBS緩沖液3倍稀釋，12 000 r/m i n離心，鼻拭子經適量PBS稀釋，參照病毒RN A提取試劑盒（Q IAGEN）說明書提取RN A，按照M-M u LV反轉錄試劑盒進行反轉錄制備cDN A，以cDN A為模板進行PCR擴增，體系如下：PCR M aster M i x：12.5 μL；上游引物、下游引物（BVDV鑒定引物）各1 μL；cDN A：3 μL；加去離子水補至25 μL。PCR反應程序：95℃預變性5 m i n，94℃變性30 s，退火30 s（根據引物不同設置不同退火溫度），72℃延伸30 s，30個循環，最后72℃終延伸10 m i n。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

經鑒定BVDV陽性的病料，0.22 μm濾膜過濾后取1 m L接種于M DBK細胞中，并設立對照組，待孵育1 h后，病毒與細胞充分接觸，添加6～7 m L營養液。置37℃CO2培養箱中培養4～7 d，逐日觀察細胞病變，若7 d仍不出現細胞病變，則回收培養物凍融2次，離心后取上清液接種于新的單層細胞，盲傳3代后，觀察細胞病變。出現病變者凍融3次后離心收取上清液，保存于-70℃冰箱待鑒定。如果未出現病變，則繼續盲傳，如還未出現病變，則反復凍融提取病毒RN A。試驗同時做BVDV陽性和陰性對照。

提取收集病毒液的RN A，方法參照病毒RN A提取試劑盒（Q IAGEN）說明書。按照M-M u LV反轉錄試劑盒進行反轉錄制備cDN A，如上述PCR體系進行鑒定。

1.2.2病毒的蝕斑純化M DBK鋪于6孔板內，將收獲的病毒用不含血清的DM EM維持液做10-1～10-6梯度稀釋后，接種于6孔板中培養的密度為80%的M DBK細胞上，37℃孵育1～2 h，使病毒充分吸附。將提前滅菌煮沸的低熔點瓊脂糖和2×M EM以1:1（v/v）混合后加入到細胞培養板中，使營養瓊脂糖覆蓋在細胞表面。待凝固后倒置于37℃培養箱中繼續培養。待出現病變后，利用中性紅染色。挑取單個的蝕斑置于無血清的DM EM培養液中，反復凍融3～5次，再用于接種M DBK細胞，進行下一輪的蝕斑純化，如此反復操作3代后得到純化的病毒。

2 結果與分析

2.1病毒的分離與鑒定3份樣品中其中有一份為BVDV陽性，將糞便以及鼻拭子分別接種M DBK細胞，經過3次盲傳后，接種糞便的M DBK細胞出現明顯細胞病變。經RT-PCR擴增，擴增產物進行凝膠電泳檢測，在288 bp處有明顯條帶，與預期結果一致。

圖1接種病料后MDBK細胞病變情況Fig.1Inoculation of MDCK cells

2.2病毒的蝕斑純化病毒接種細胞后，約4～5 d，顯微鏡下能看到細胞出現病變，中性紅染色后可見透明呈圓形的蝕斑，大小不完全相同，但邊緣清晰。細胞病變特征為細胞死亡、變圓、聚集成堆、脫落、脫落的細胞變圓，漂浮在維持液中，并逐漸縮小，活細胞在瓶壁上成拉網狀；隨著傳代次數的增加，出現病變的時間縮短。而未接毒的細胞鏡下未見變化，中性紅染色后也不出現蝕斑。

3 討論和結論

本試驗采集黑龍江省某牛場疑似感染BVDV患畜的糞便以及鼻拭子，進行樣品處理，接種細胞培養，盲傳3代后接種糞便的M DBK細胞出現CPE，收毒并提取RN A，進行PCR鑒定，最后通過蝕斑純化分離病毒。本試驗分離到的病毒出現典型CPE，因此分離到的病毒為CP型。

病毒的分離過程中細胞的培養是非常重要的環節，在細胞培養中，對血清的選擇是尤其關鍵的，因為BVDV可以通過胎盤屏障傳給胎牛，這可能造成在胎牛血清中含有BVDV抗體，市場上經過處理的血清也有可能含有BVDV殘留，聶兆晶等[8]在細胞培養中選用的是馬血清，可以避免牛血清中BVDV抗體的干擾。而本試驗在細胞培養過程中選取的血清為gi bco胎牛血清，并且從PCR結果中陰性對照中也說明此血清中無BVDV殘留。

蝕斑純化病毒時，將病毒進行不同梯度的稀釋接種于M DBK細胞上，病毒在細胞上增殖，對病毒濃度的控制是試驗的關鍵，一個孔中的蝕斑數目最好不超過10個，挑取蝕斑細胞，將其繼續接毒傳代3次以上得到純化病毒。本試驗成功分離到BVDV病毒，這為后續病毒基因結構的研究奠定基礎。

[1]TAUTZ N,TEW S B A,M EYERS G.The M ol ecul ar Biol ogyofPesti vi ruses[J].Advancesi n vi rus research,2015,93:47-160.

[2]W AN G F I,DEN G M C,H UAN G Y L,et al.Structuresand Functi onsofPesti vi rusGl ycoprotei ns:N otSi m pl y Surface M atters[J].Vi ruses,2015,7(7):3506-3529.

[3]何延華，黃新，鐘發剛，等.牛病毒性腹瀉病毒基因1型全基因組的測序分析[J].中國獸醫科學，2012，42（3）：253-257.

[4]SAYERS R G,SAYERS G P,GRAH AMD A,et al.Impactofthree i nacti vated bovi ne vi raldi arrhoea vi rus vacci nes on bul k m i l k p80(N S3) ELISA test resul ts i n dai ry herds[J].Veterinary j ournal,2015,205(1):56-61.

[5]李樹博.牛病毒性腹瀉病毒分子生物學特性及流行病學研究進展[J].畜牧獸醫科技信息，2015，3（5）：5-6.

[6]姚偉.遼寧地區規模化奶牛場牛病毒性腹瀉-黏膜病血清學調查[J].現代畜牧獸醫，2015，5（4）：36-40.

[7]王建領，付彤，劉杰，等.牛病毒性腹瀉分子及血清流行病學研究進展[J].河南農業科學，2012，41（3）：7-11.

[8]聶兆晶，田夫林，姜世金.一株2型牛病毒性腹瀉病毒的分離鑒定及其在M DBK細胞上的克隆純化[J].西北農業學報，2012，21（1）：21-25.

Isolation and identification of Bovine viral diarrhea virus

Bi Yi ng,N i H ongbo*
(H ei l ongj i ang Bayi Agri cul tural Uni versi ty,H ei l ongj i angDaqi ng163319)

W i th suspected bovi ne vi ral di arrhea vi rus di sease m ateri al separati on and i denti fi cati on.In thi s study,cow s of H ei l ongj i ang Provi nce W anda cattl e i nfected w i th bovi ne vi raldi arrhea vi rus w ere di seased acqui si ti on.Speci m ens col l ected w ere i nocul ated by M DBK cel l s and reproduced bl i ndl y 3 generati ons.The vi ralRN A w as am pl i fi ed by PCR i denti fi cati on.Fi nal l y,the coll ected vi rus by pl aque puri fi cati on experi m ents puri fi ed vi rus.Resul t:The vi rus i nocul ati on obvi ous l esi ons on M DBK cel l.PCR am pl i fi ed the expected am pl i fi cati on segm ent.The vi rus w as i sol ated by 3 ti m es pl aque puri fi ed.Concl usi on:Successful l y i sol ated the bovi ne vi raldi arrhea virus.

Bovi ne vi ral di arrhea vi rus;M DBK;Identi fi cati on;The pl aque puri fi cati on

S852.659.6

B

1672-9692(2016)07-0014-03

2016-05-25

畢瑩（1993-），女，在讀碩士，主要從事分子細菌學和免疫學研究。

倪宏波（1972-），教授，博士生導師，主要從事分子細菌學和免疫學研究。