土壤高壓蒸汽滅菌的條件優化及其對植物生長的影響

曹鵬+付學鵬+王紹嫻+吳鳳芝

摘要：利用高壓蒸汽對土壤滅菌是研究土壤微生物學的常用方法，用高壓蒸汽滅菌方法（121 ℃，30 min）對土壤滅菌，調查滅菌次數對土壤滅菌效果、土壤化學性質變化、黃瓜幼苗生長的影響。結果表明，滅菌1次即可完全清除土壤里的真菌，但滅菌3次才可完全清除土壤里的細菌；滅菌土壤的pH值和EC值均顯著高于未滅菌土壤，且隨著滅菌次數的增加，pH值和EC值都呈現上升趨勢；土壤滅菌顯著降低黃瓜幼苗的株高和地上部鮮質量，并且隨著滅菌次數的增加，黃瓜幼苗的株高和地上部鮮質量都呈現下降趨勢；與滅菌2次的土壤相比，滅菌3次的土壤對黃瓜幼苗生長的抑制作用不顯著，并且pH值和EC值的變化也不顯著。因此，在土壤微生物學研究中需要根據需要選擇滅菌次數。

關鍵詞：高壓蒸汽滅菌；滅菌次數；土壤微生物；植物生長

中圖分類號： Q93-334；S642.201 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0456-03

土壤滅菌能夠消除或降低土壤微生物活性，是土壤生物學研究中常用的試驗方法。在研究土壤-微生物-植物之間的相互作用、土壤單一菌群、土壤酶、土壤有機質降解與吸附以及殺菌劑在土壤中的移動等方面都要求土壤的無菌環境[1-4]。比如作物連作會降低作物的產量和品質，造成嚴重的連作障礙。對土壤進行滅菌能夠研究土壤微生物對作物連作障礙的“貢獻”。季尚寧等對連作大豆的土壤進行滅菌處理后種植大豆，發現經過滅菌的大豆茬土壤栽培的株高、干質量和鮮質量均大大超過了未滅菌的豆茬土壤，緩解了連作障礙[5]；吳鳳芝等對連作黃瓜的土壤滅菌后，種植黃瓜幼苗的株高、莖粗和根系活力都顯著高于未滅菌土壤中的植株[6]。

目前常用的土壤滅菌方法有高溫滅菌法、γ射線滅菌法、化學熏蒸法、苯菌靈抑制法和物理割斷法等5種常用方法。這5種方法各有利弊：高溫滅菌法、γ射線滅菌法和化學熏蒸法適用于室內試驗，但它們對土壤理化性質有一定的影響；化學熏蒸法會污染環境；苯菌靈抑制法和物理割斷法適用于室外試驗，其中苯菌靈抑制法也會污染環境，須嚴格控制藥劑用量；物理割斷法雖然環保，但可能影響土壤中水分和營養成分的交換[2-3，7-9]。

在眾多的土壤滅菌方法中，高壓蒸汽滅菌是實驗室普遍使用的方法，國內外大量研究報告中都采用高壓蒸汽滅菌方法進行土壤滅菌[3，10-11]。高壓蒸汽滅菌的效果受到滅菌的溫度、滅菌時間、滅菌次數等條件的影響，并且高壓蒸汽滅菌能夠引起土壤理化性質的改變，進而影響植物的生長。Mahmood等用121℃高壓蒸汽對土壤滅菌1 h，顯著提高了土壤的電導率、水溶性碳和可溶性錳，提高了小麥根的生物量、根長、表面積、體積及根尖數[3]。Verhagen等為研究根際細菌誘導的系統抗性，對土壤進行蒸汽滅菌2次，每次20 min[8]。李會娜等對土壤進行高壓滅菌3次（121 ℃、30 min，連續3 d），發現菜園土滅菌后，紫莖澤蘭的株高和生物量顯著低于對照處理（未滅菌），而對于番茄的生長具有促進作用[12]。梁智等用高壓蒸汽滅菌，在1 個大氣壓下高溫濕熱滅菌2 h，使棉花株高降低12.7%，地上部干物質質量減少66.7%，地下部干物質質量減少44.5%[13]。由此可見，對于土壤的高壓蒸汽滅菌的條件比較混亂，沒有統一的標準，最重要的是沒有驗證不同滅菌條件下的滅菌效果。目前對于高壓蒸汽滅菌的溫度、時間、次數、滅菌效果及其對植物生長的影響尚未見報道。本試驗在前人研究的基礎上，研究滅菌次數對土壤真菌、細菌的清除效果，以及對黃瓜幼苗生長的影響，以期對利用高壓蒸汽進行土壤滅菌的條件進行優化，為相關研究提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種 黃瓜品種為津研四號，購自天津科潤黃瓜研究所。

1.1.2 供試土壤 土壤為采自東北農業大學園藝站的育苗土。

1.2 方法

1.2.1 土壤滅菌 試驗共設4個處理：未滅菌（CK）、滅菌1次（CS1）、滅菌2次（CS2）、滅菌3次（CS3）。將2 kg土壤樣品裝入直徑為25 cm、長度為40 cm的滅菌袋（高密度聚乙烯膜，北京鑫明宏塑料有限公司）中圖1，于立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）中滅菌，每次滅菌的條件為121 ℃（0. 1～0.2 MPa）高溫滅菌30 min。每次滅菌間隔24 h。

1.2.2 滅菌土壤中細菌和真菌的培養和數量檢測 參照Komad等的方法[14-15]，用平板培養法測定黃瓜根際土壤中細菌和真菌的數量。細菌測定采用牛肉膏蛋白胨培養基；真菌測定采用馬丁氏培養基。

[FK（W13][TPCP1.tif]

本試驗中所用的滅菌袋每袋裝入2 kg土，是為了保證滅菌效果和高壓滅菌器的容積，使其更有利于滅菌。將每個處理的土壤隨機取出3袋，在超凈工作臺（DL-CJ-2ND，北京東聯哈爾儀器制造有限公司）中取袋中間部分的土壤5 g，加入到盛有45 mL無菌水的錐形瓶（250 mL）中，振蕩15 min使土樣中菌體、芽孢或孢子均勻分散，靜置1 min后依次制成10-2、10-3、10-4、10-5梯度的土壤稀釋液。

在超凈工作臺中，依次在分離細菌和真菌的培養基上用平板涂布法涂布10-5、10-3、10-2的土壤稀釋液100 μL，每個處理重復3次，每個重復涂布5個平板。置于28 ℃恒溫培養箱中暗培養3～7 d，觀察計數并計算單位質量干土細菌和真菌的數量。

1.2.3 滅菌次數對土壤pH值和EC值的影響 根據鮑士旦等的方法[16]，分別取不滅菌（CK）、滅菌1次（CS1）、滅菌2次（CS2）、滅菌3次（CS3）土壤各5 g溶于25 mL無菌蒸餾水（土水比1 ∶5）中，充分混勻后分別用pH計（S20，梅特勒-托利多儀器有限公司）和電導率儀（FE30，梅特勒-托利多儀器有限公司）測定pH值和EC值。

1.2.4 土壤滅菌次數對黃瓜幼苗生長的影響 2014年11月30日播種育苗，子葉展平時定植于裝有上述不同處理土壤的營養缽（8 cm×8 cm）中，每缽200 g土、1株黃瓜幼苗。每個處理30次重復，共120缽。于東北農業大學園藝站人工氣候室培養，光照時間和濕度設置：光照時間12 h/d（6：00—20：00），光照度為7 000 lx；濕度為75%。每2 d每缽定量澆50 mL無菌水。不使用殺菌劑和殺蟲劑。為了消除光照造成的誤差，定期調換幼苗的位置。

在定植20 d（2葉1心期）和40 d（4葉1心期）時取樣，每個處理分別隨機選10株黃瓜幼苗測定株高和地上部鮮質量。

2 結果與分析

2.1 滅菌次數對土壤細菌和真菌數量的影響

高壓蒸汽滅菌能有效殺死土壤中的微生物。由表1、圖2可見，與對照相比，滅菌1次（CS1）可以有效地殺滅土壤中的真菌，且培養3、4 d的平板都未見真菌菌落出現，說明滅菌1次即可殺滅土壤中的真菌；但是對于細菌，滅菌2次后還有大量的菌落出現，直到滅菌3次才未見菌落出現。

2.2 滅菌次數對土壤pH值和EC值的影響

由圖3可以看出，未滅菌的土壤pH值顯著低于滅菌土壤，但是滅菌不同次數的土壤其pH值變化不顯著；土壤EC值隨土壤滅菌次數的增加而升高，但是滅菌2、3次的EC值差異不顯著。

2.3 滅菌次數對黃瓜幼苗生長的影響

黃瓜幼苗定植40 d的生長情況見圖4。本研究中未滅菌土壤種植的黃瓜幼苗在20、40 d時地上部鮮質量和株高均顯著高于滅菌土壤；與對照相比，隨著滅菌次數的增加，在20 d時，黃瓜幼苗的地上部鮮質量分別減少了25%、49%和52%，株高分別降低了13%、27%和29%，但2次滅菌和3次滅菌差異不顯著；在40 d時，黃瓜地上部鮮質量分別減少了25%，60%和63%，株高分別降低了24%、37%和40%，但2次滅菌和3次滅菌差異不顯著。

3 討論與結論

高壓蒸汽滅菌是在較高的溫度和氣壓下進行的，勢必會對土壤的理化性質產生影響，進而影響植物的生長。Mahmood 等用121 ℃高壓蒸汽對土壤滅菌1 h，顯著提高了土壤的電導率[3]，和本試驗結果一致。李會娜等用高壓蒸汽滅菌3次的菜園土培養紫莖澤蘭，發現紫莖澤蘭的株高和生物量顯著低于對照處理（未滅菌）[12]。梁智等用高壓蒸汽滅菌的土壤種植棉花，使棉花株高降低12.7%，地上部干物質質量減少66.7%，地下部干物質質量減少44.5%[13]。

在本試驗中，利用高壓蒸汽滅菌器，在121 ℃（0.1～0.2 MPa）條件下滅菌，每次滅菌30 min，滅菌1次就能消除土壤中的真菌，而消除細菌則需要滅菌3次。滅菌次數越多必然使滅菌效果更好，但是不可避免地會對土壤的理化性質造成影響。與未滅菌的土壤相比，滅菌顯著提高了土壤的pH值和EC值，但是滅菌2次和滅菌3次后這2個指標沒有顯著變化。同樣，從對植物生長的反饋結果來看，幾次滅菌的土壤均顯著抑制了黃瓜幼苗的生長，但是滅菌2次和3次的土壤對黃瓜幼苗生長的影響則不顯著。因此，如果想消除土壤中的真菌，只要滅菌1次即可；而要消除所有的微生物，則最好滅菌3次。

參考文獻：[HJ1.66mm]

[1]Degrange V，Lensi R，Bardin R. Activity，size and structure of a Nitrobacter community as affected by organic carbon and nitrite in sterile soil[J]. Fems Microbiology Ecology，1997，24（2）：173-180.

[2]Luo Y M，Yan W D，Christie P. Soil solution dynamics of Cu and Zn in a Cu-and Zn-polluted soil as influenced by γ-irradiation and Cu-Zn interaction[J]. Chemosphere，2001，42（2）：179-184.

[3]Mahmood T，Mehnaz S，Fleischmann F，et al. Soil sterilization effects on root growth and formation of rhizosheaths in wheat seedlings[J]. Pedobiologia，2014，57（3）：123-130.

[4]Rro[KG-*5]co E，Kosegarten H，Harizaj F，et al. The importance of soil microbial activity for the supply of iron to sorghum and rape[J]. European Journal of Agronomy，2003，19（4）：487-493.

[5]季尚寧，肖玉珍，田慧梅，等. 土壤滅菌對連作大豆生長發育的影響[J]. 東北農業大學學報，1996，27（4）：326-329.

[6]吳鳳芝，王 偉，欒非時. 土壤滅菌對大棚連作黃瓜生長發育影響[J]. 北方園藝，1999（5）：49.

[7]Shcherbakova T A，Nikitin D I，Volkovskaia N G. Use of gamma-irradiation of soil for analyzing the state of microbial coeneses[J]. Mikrobiologiia，1974，44（2）：325-329.

[8]Verhagen B W，Glazebrook J，Zhu T，et al. The transcriptome of rhizobacteria-induced systemic resistance in Arabidopsis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2004，17（8）：895-908.

[9]侯永俠，周寶利，吳曉玲，等. 土壤滅菌對辣椒抗連作障礙效果[J]. 生態學雜志，2006，25（3）：340-342.

[10]謝 越，楊高文，周翰舒，等. 叢枝菌根真菌研究中土壤滅菌方法綜述[J]. 草業科學，2012，29（5）：724-732.

[11]Mcnamara N P，Black H，Beresford N A，et al. Effects of acute gamma irradiation on chemical，physical and biological properties of soils[J]. Applied Soil Ecology，2003，24（2）：117-132.

[12]李會娜，劉萬學，萬方浩. 土壤滅菌對紫莖澤蘭和番茄的反饋作用[J]. 中國農學通報，2011，27（16）：186-189.

[13]梁 智，周 勃，鄒耀湘，等. 土壤濕熱滅菌對連作棉花生長發育的影響[J]. 西北農業學報，2007，16（2）：87-89.

[14]Komada H. Development of a selective medium for quantitative isolation of Fusarium oxysporum from natural soil[J]. Review of Plant Protection Research，1975，8：114-124.

[15]周德慶. 微生物學實驗教程[M]. 北京：高等教育出版社，2013.

[16]鮑士旦. 土壤農化分析[M]. 北京：中國農業出版社，1980.