葡萄ISSR—PCR反應體系的建立與正交設計優化

張娜+李群+高興旺+賴曉輝+李佳+丁金鵬

摘要：建立和優化穩定的葡萄ISSR-PCR反應體系，為進一步開展葡萄遺傳多樣性研究和品種選優提供理論依據。運用改良的CTAB法從葡萄嫩葉中提取基因組總DNA，通過單因素試驗分析dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、DNA模板用量、Taq DNA聚合酶用量等5個因素對葡萄ISSR-PCR反應體系擴增結果的影響，并采用正交設計試驗方法優化建立葡萄ISSR-PCR最佳反應體系。優化的最佳ISSR-PCR反應體系（20 μL）為：10×PCR buffer、0.225 mmol/L dNTPs、Taq DNA聚合酶1.0 U、1.00 μmol/L引物、2.75 mmol/L Mg2+、DNA模板30 ng。利用優化的ISSR-PCR 反應體系能夠擴增獲得清晰、穩定的DNA條帶，可用于后續的葡萄種質資源遺傳多樣性分析。

關鍵詞：葡萄；ISSR-PCR；反應體系；單因素試驗；正交設計；優化

中圖分類號： S663.103 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0047-04

葡萄屬于葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis L.）藤本植物，是起源最古老的果樹之一，其果實可用于釀酒、鮮食、制汁等，具有重要的經濟價值，在世界范圍內廣泛栽培。由于葡萄的基因組高度雜合，使得其具有豐富的種質資源。種質資源是進行農業生產和創新育種的重要物質保障，也是解決各種病蟲害問題有利的“基因武器庫”。因此，充分了解葡萄種質資源的遺傳信息、分析其種質資源遺傳多樣性，對有效利用現有的葡萄種質資源以及促進和加快葡萄分子育種進程具有重要意義。目前，分子標記技術已廣泛應用于葡萄遺傳多樣性研究，以期為進一步開展葡萄分子育種奠定了一定的基礎。黃遠飛利用RAPD技術對53份葡萄材料進行遺傳多樣性分析，發現53份葡萄材料間具有較高的遺傳多樣性[1]。吳子龍等建立了葡萄SSR標記和ISSR的反應體系，并研究了葡萄種質資源的遺傳多樣性[2-3]。張淑靜利用SSR技術分析了39份葡萄品種的遺傳多樣性，發現這些材料間存在明顯的遺傳多態性差異[4]。郭大龍等建立了適用于葡萄的SRAP反應體系，為葡萄種質遺傳多樣性評價、遺傳改良等研究提供了基礎[5]。張君玉等建立了葡萄的目標起始密碼子多態性的反應體系，可用于葡萄種質遺傳多樣性評價[6]。賴呈純等也分別建立了適用于葡萄的ISSR-PCR反應體系。ISSR標記技術結合了SSR和RAPD等2種標記技術的優點，但其最關鍵的步驟是須要針對不同的物種建立相應的PCR反應體系[7-8]。雖然前人已建立了適用于葡萄的ISSR技術的PCR反應體系，但均未對Mg2+這一影響因素進行分析，因此本研究通過優化ISSR-PCR反應中的各項參數，建立適用于葡萄ISSR技術的最佳反應體系。以新疆葡萄種質資源嫩葉為材料，通過單因素試驗和正交設計試驗優化葡萄種質資源ISSR反應體系，并對PCR反應過程中的退火溫度進行篩選，為進一步開展葡萄遺傳多樣性研究和品種選優提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試葡萄種質嫩葉采自新疆鄯善縣新疆瓜果研究中心葡萄種質資源圃，-80 ℃冰箱中保存備用。ISSR引物序列參考哥倫比亞大學公布的序列，送往華大基因進行合成；所用試劑dNTPs和Taq DNA聚合酶（簡稱Taq酶）購自寶生物工程（大連）有限公司，其他藥品均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄幼葉基因組DNA的提取與檢測 采用改良的CTAB法提取葡萄幼葉基因組DNA[9]。改良的CTAB配方為：3% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、2 mmol/L NaCl、4% PVP40、2% β-巰基乙醇、20 mmol/L偏重亞硫酸鈉；提取步驟參照徐美隆等的方法[10]進行。取1.0 μL DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并通過紫外分光光度計檢測D260 nm/D280 nm，從而確定DNA的濃度和純度。

1.2.2 單因素篩選試驗 研究dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物UBC848[（CA）8RG]濃度、DNA模板用量、Taq酶用量5個因素對ISSR-PCR體系的影響（表1）。在單因素分析過程中，當對某一個因素進行梯度優化時，其他因素保持不變，得到的最優濃度帶入下一個因素的梯度試驗，依次進行。擴增程序為：95 ℃預擴增3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，共40個循環；最終72 ℃延伸10 min[11]。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后凝膠成像系統拍照保存。

1.2.3 ISSR-PCR反應體系的正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，對篩選出的dNTPs濃度和Mg2+濃度等的較優濃度進一步細化，引物濃度和DNA模板用量則直接使用單因素篩選的3個較適水平。采用L9（34）進行正交設計，檢測dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物UBC848濃度及DNA模板用量對ISSR-PCR 結果的影響，從中篩選出最佳組合，方案如表2所示，擴增程序與單因素試驗結果一致。

1.2.4 ISSR-PCR反應體系退火溫度的優化 利用溫度梯度PCR擴增儀，對引物842[（GA）8YG]設置11個溫度梯度，即48.0、48.4、49.3、50.7、52.2、53.8、55.5、57.1、58.6、60.0、60.9 ℃，篩選最佳退火溫度。

1.2.5 最佳體系穩定性檢測 利用篩選的最佳體系和引物842對24個不同葡萄品種DNA樣品進行PCR擴增，檢測最優體系的穩定性。

2 結果與分析

2.1 葡萄幼葉基因組DNA純度的檢測結果

采用改良的CTAB法提取的葡萄幼葉基因組DNA無色、透明，經紫外分光光度計檢測發現，D260 nm/D280nm均在1.75～1.88范圍內；瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖1）顯示，DNA條帶清晰、明亮、整齊、雜質含量低且基本無降解，可用于開展后續試驗。

2.2 葡萄ISSR-PCR反應體系單因素水平的優化結果

2.2.1 dNTPs濃度對ISSR-PCR反應體系的影響 由圖2可知，隨著dNTPs濃度的逐漸增大，擴增的條帶數和條帶亮度均逐漸增高；當dNTPs濃度為 0.05 mmol/L時，擴增反應不完全，擴增的條帶數少且亮度暗；dNTPs濃度為0.20～0.30 mmol/L 時，擴增的條帶多且亮度較高，所以初步確定dNTPs濃度在0.20～0.30 mmol/L較為合適。

2.2.2 Mg2+濃度對ISSR-PCR反應的影響 從圖3可以看出，Mg2+濃度在0.5～3.5 mmol/L范圍內增大時，擴增條帶明顯增多，當Mg2+濃度為2.0 mmol/L時，擴增條帶數達到最高，當Mg2+濃度增大至2.0～3.5 mmol/L時，擴增條帶數基本不變，但亮度增加。因此，初步確定Mg2+濃度在2.0～3.0 mmol/L 較為合適。

2.2.3 DNA模板用量對ISSR-PCR反應的影響 不同DNA模板用量的擴增結果（圖4）顯示，DNA模板濃度在20～120 ng范圍內逐漸增大時，擴增條帶數基本不變，但條帶亮度有所增加；其中模板濃度在40～80 ng時，條帶亮度最佳，繼續增至100 ng時，條帶亮度過高，因此初步確定DNA模板濃度在40～80 ng較合適。

2.2.4 引物濃度對ISSR-PCR反應的影響 不同引物濃度擴增結果（圖5）顯示，當引物濃度在0.25～1.25 μmol/L范圍內逐漸增大時，PCR擴增條帶的數量增加，亮度也有所增大，當濃度為1.25 μmol/L時條帶最多；當引物濃度繼續增至1.75 μmol/L時，PCR擴增出的條帶數量和亮度變化不明顯，因此初步確定引物濃度在0.75～1.25 μmol/L較合適。

2.2.5 Taq酶用量對ISSR-PCR反應的影響 由圖6可知，Taq酶用量為0.5 U時，條帶亮度較暗，當Taq酶用量在1.0 U 時，PCR擴增條帶亮度明顯增大；隨著Taq酶用量的繼續增加，PCR擴增的條帶亮度增加不明顯，所以最終確定Taq酶用量為1 U。

2.3 正交設計試驗結果

由圖7可知，1號組合片段模糊，2號、3號組合小片段未擴增出，4號、6號、7號、8號、9號組合大片段擴增結果較模糊，只有5號組合條帶亮度均勻且穩定。綜合考慮條帶亮度及豐富度，最終確定5號組合為最佳的ISSR-PCR反應體系組合，即每20 μL的反應體系中含有10×PCR buffer（Mg2+ free）、dNTPs 0.225 mmol/L、Taq酶1.0 U、引物1.00 μmol/L、Mg2+ 2.75 mmol/L、DNA模板30 ng。

2.4 最適退火溫度的確定

引物842不同退火溫度的擴增結果（圖8）顯示，當退火溫度較低時，ISSR-PCR擴增的條帶模糊，說明擴增的特異性較差；當退火溫度較高時，擴增出大片段但條帶模糊，說明擴增效率不高；退火溫度為55.5 ℃時，擴增條帶數較多且條帶清晰。因此，確定55.5 ℃為引物842的最佳退火溫度。

2.5 優化ISSR-PCR反應體系穩定性檢測結果

以24個葡萄品種為材料，檢測正交試驗設計中組合5的 PCR反應體系的穩定性，結果（圖9）顯示，所有品種均能得到較為清晰整齊的條帶。說明該正交組合可用于不同葡萄品種中擴增出較好的條帶，適用于葡萄的ISSR分析。

3 結論與討論

ISSR技術是基于PCR的一種分子標記，其擴增反應常受引物濃度、DNA模板用量、Mg2+濃度、dNTP濃度及Taq酶用量等多種因素的影響，此外，反應體系還受退火溫度的影響[12]。因此，本研究針對這些影響因子進行優化設計，并建立葡萄ISSR-PCR反應體系，結果表明，引物濃度、DNA模板用量、Mg2+濃度、dNTP濃度及Taq酶用量對PCR擴增反應結果均有不同程度的影響，并篩選出55.5 ℃為引物842的最佳退火溫度。

目前，已有不少研究者建立了適用于葡萄的ISSR-PCR反應體系，但均未對Mg2+濃度這一影響因素進行分析。通過本研究結果可以看出，Mg2+濃度對ISSR-PCR反應體系的影響較明顯，可能是因為Taq酶需Mg2+激活，同時引物與模板的雙鏈雜交體的解鏈也受二價陽離子的影響[13]。最終確定Mg2+濃度為2.75 mmol/L，與茶樹[14]、楊樹[15]、枇杷[16]等物種的最適Mg2+濃度接近。

DNA模板的質量是保證ISSR-PCR擴增的重要因素之一，最佳的模板濃度范圍取決于研究物種和模板純度。在DNA 模板不純的情況下，寧可使用有效濃度范圍內的最低限度，使抑制Taq酶活性的影響降到最低[14]。宣繼萍等確定蘋果ISSR反應體系中DNA模板用量為20 ng[17]，劉曉靜等確定益智ISSR反應體系中DNA模板用量為100 ng[18]，代培紅等確定葡萄ISSR反應體系中DNA模板用量為30 ng[8]，可見不同物種研究須確定不同的ISSR-PCR模板用量。本研究確定DNA模板用量為30 ng，與代培紅等的研究結果[8]一致。

在其他條件不變的情況下，當引物濃度過高時，引物結合模板的效率增高，進而導致大量的非特異性擴增，同時引物本身也容易形成二聚體，導致部分dNTPs和Taq酶被消耗，從而降低模板的擴增效率；當引物濃度過低時，引物與模板不能有效結合，則導致不能有效檢測出所有的相應位點，使得多態性降低[19]。本研究確定引物濃度為1.00 μmol/L，高于賴呈純等對葡萄種質資源ISSR體系的研究結果[7-8]，這可能與試驗材料、條件不同有關。

已有研究發現，dNTPs濃度會顯著影響PCR擴增效率，濃度過高，會造成錯誤滲入；濃度過低，則會影響擴增產率[16]。在羅漢果[12]、龍眼[20]等物種中確定的最適dNTPs濃度為0.1～0.8 mmol/L，本研究確定的dNTPs濃度為0.225 mmol/L，在上述研究范圍之內，且濃度更精確。

酶的用量也直接關系到試驗結果，量多不僅會增加試驗成本，還容易產生非特異性擴增產物；量少則會使酶過早地消耗完，產物合成效率低[18]。本研究最終確定Taq酶用量為1.0 U，與周俊亞等的研究結果[12，21]一致。

本研究結果表明，不同的反應體系擴增的ISSR結果有一定的差異，PCR反應體系的質量直接影響后續ISSR-PCR的準確性。在體系研究過程中，一方面要保證體系的完整性，另一方面又要考慮到試驗成本問題，須在二者之間找到一個平衡點，因此本研究在單因素試驗找出各因素較合適的濃度范圍的基礎上進行正交設計分析，最終確定最佳的反應體系，且建立的葡萄ISSR-PCR反應體系穩定可靠，可為后續的葡萄種質資源分析、品種鑒定、遺傳多樣性分析、分子育種等方面的研究提供參考。利用正交設計優化得到的ISSR-PCR反應體系可在一系列的葡萄品種中擴增獲得清晰、穩定的DNA條帶，可用于后續的葡萄種質資源遺傳多樣性分析。

參考文獻：

[1]黃遠飛. 葡萄種質資源RAPD分析及親緣關系研究[D]. 長沙：湖南農業大學，2005.

[2]吳子龍，方連玉，王 軍，等. 15份葡萄種質親緣關系的ISSR分析[J]. 果樹學報，2006，23（4）：605-608.

[3]吳子龍，王 軍，沈育杰，等. 山葡萄種內遺傳多樣性的SSR分析[J]. 果樹學報，2008，25（6）：821-827.

[4]張淑靜. 葡萄SSR反應體系的建立及遺傳多樣性分析[D]. 保定：河北農業大學，2008.

[5]郭大龍，張君玉，劉崇懷. 葡萄SRAP反應體系優化及引物篩選[J]. 基因組學與應用生物學，2010，29（2）：379-384.

[6]張君玉，郭大龍，龔 瑩，等. 葡萄目標起始密碼子多態性反應體系的優化[J]. 果樹學報，2011，28（2）：209-214.

[7]賴呈純，范麗華，謝鴻根，等. 葡萄ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J]. 生物技術通報，2012（2）：159-164.

[8]代培紅，朱 瑜，姚正培，等. 葡萄種質資源ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J]. 南方農業學報，2013，44（8）：1258-1262.

[9]田淑芬，李樹海，高 楊，等. 玫瑰香葡萄不同時期葉片提取DNA純度的比較[J]. 天津農業科學，2003，9（2）：5-7.

[10]徐美隆，章 雨，倪細爐. 一種高質量葡萄基因組DNA提取方法[J]. 北方園藝，2011（15）：172-174.

[11]王果平，樊叢照，李曉瑾，等. 新疆貝母 DNA 提取及 ISSR-PCR 體系的建立與優化[J]. 種子，2012，31（8）：27-30， 35.

[12]周俊亞，賓曉蕓，彭云滔，等. 羅漢果ISSR-PCR反應體系的建立[J]. 廣西師范大學學報：自然科學版，2004，22（3）：81-84.

[13]賀 佳，丁小余，褚必海，等. 澤瀉ISSR反應體系的建立與優化[J]. 南京師大學報：自然科學版，2006，29（3）：86-90.

[14]姚明哲，王新超，陳 亮，等. 茶樹ISSR-PCR反應體系的建立[J]. 茶葉科學，2004，24（3）：172-176， 206.

[15]汪結明，項 艷，吳大強，等. 楊樹ISSR反應體系的建立及正交設計優化[J]. 核農學報，2007，21（5）：470-473， 513.

[16]付 燕，羅 楠，楊 芩，等. 枇杷屬植物ISSR反應體系的建立和優化[J]. 果樹學報，2009，26（2）：180-185.

[17]宣繼萍，章 鎮. 適合于蘋果的ISSR反應體系的建立[J]. 植物生理學通訊，2002，38（6）：549-550.

[18]劉曉靜，王文泉，郭凌飛. 益智ISSR-PCR反應體系建立與優化[J]. 生物技術，2008，18（3）：33-37.

[19]隋曉青，王 堃. 克氏針茅ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J]. 草業學報，2008，17（3）：71-78.

[20]曾黎輝，洪自同，許家輝，等. 龍眼ISSR反應體系的建立和優化[J]. 中國農學通報，2007，23（9）：111-114.

[21]趙麗華. 石榴ISSR-PCR反應體系的正交設計優化[J]. 北方園藝，2010（19）：148-152.