黑豆紅色素對亞硝酸鹽體外清除作用的研究

褚盼盼 李蕾 王潔 任益平 陳月桃

摘 要：該文以黑豆紅色素為試驗材料，采用分光光度法研究了不同的pH值、反應溫度、反應時間、黑豆紅色素濃度等條件對亞硝酸鹽體外清除作用的影響，確定黑豆紅色素體外清除亞硝酸鹽的最佳條件。結果表明，黑豆紅色素對亞硝酸鹽具有較強的體外清除作用，在黑豆紅色素濃度為5.5mg/mL、pH為2.6、反應溫度為37℃、反應時間為4h時清除率最大，達到了99.50%，高于對照Vc。

關鍵詞：黑豆紅色素；亞硝酸鹽；清除率

中圖分類號 TS264.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）19-0039-03

Abstract：Making Black beans red pigment as material， the influence of different pH， reaction temperature， reaction time， black beans red pigment concentration conditions on the nitrite scavenging effect in vitro by spectrophotometric method are studied， to ascertain the best condition of black beans red pigment removal of nitrite in vitro. Research shows that black beans red pigment of nitrite has strong influence on vitro， while the black beans red pigment concentration is 5.5 mg/mL， pH is 2.6， the reaction temperature is 37 ℃，and reaction time is 4 h， clearance reaches the largest to 99.50%， higher than controls Vc.

Key words：Black beans red pigment；Nitrite；Clearance

亞硝酸鹽是一種普遍存在于人們生產和生活中的物質。在食品中，亞硝酸鹽可以作為肉制品的護色劑和增色劑，還可增加肉的風味，同時可以作為防腐劑使用，防止及阻止肉毒梭菌的生長和增長肉制品的貨架期。但由于亞硝酸鹽是強氧化劑，其大量進人體后會引起高鐵血紅蛋白癥，使血液中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去運氧的功能，致使組織缺氧，出現青紫而中毒，還可使血管擴張、血壓降低。另外，亞硝酸鹽被人體食入之后，會在人體內形成亞硝胺，而亞硝胺是一種強烈的致癌作物質，引起食道、胃、肝和大腸等部位的癌癥。目前，國內外一些學者從植物中提取出天然活性成分對亞硝酸鹽進行了清除作用的研究[1-9]。黑豆紅色素就是一種天然的、無毒無害的常用食品添加劑[10]，具有延緩衰老、保肝護肝、抗菌、抗肥胖等作用[11-14]。本文通過研究黑豆紅色素對亞硝酸鹽體外清除的作用，研究各種反應條件對亞硝酸鹽體外清除率的影響，確定黑豆紅色素體外清除亞硝酸鹽的最佳條件，旨在為開發天然植物源的亞硝酸鹽體外清除劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 黑豆紅色素，課題組自制[15]；無水乙醇、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、Vc等均為國產分析純。UV—1601紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司；RE—52旋轉蒸發儀：鄭上海亞榮生化儀器廠；DHG-9145A電熱鼓風干燥箱：上海凱朗儀器設備廠；HH—6數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；Neofμge 13R臺式高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 亞硝酸鈉標準曲線的繪制 參照GB 5009.33-2010食品安全國家標準《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法，亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法測定。分別吸取0（零管）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5mL亞硝酸鈉標準使用液（5.0μg/mL），分別置于25mL帶塞比色管中。分別往比色管中添加1mL對氨基苯磺酸溶液（4g/L），搖晃混合均勻，靜止放置3～5min后在依次分別加入0.5mL鹽酸萘乙二胺溶液（2g/L）。加水至比色管上刻度線，搖晃混合均勻，靜止放置15min，用零管調節零點，于波長538nm處測吸光度值。每組試驗樣品做三次平行試驗，以亞硝酸鈉濃度（μg/mL）為橫坐標、吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.0256x+0.0046，相關系數R2=0.997。

1.2.2 不同條件下黑豆紅色素對亞硝酸鹽體外清除作用的影響

1.2.2.1 pH值 在6支25mL比色管中分別加入2.0mg/mL的黑豆紅色素溶液1mL，然后各加入1mL亞硝酸鈉標準溶液（200μg/mL），加入pH分別為2.6、3.0、3.4、3.8、4.2、4.6磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液8mL，混勻后于37℃下反應1h。吸取1mL上述反應液于比色管中，按照1.2.1的方法測定538nm處的吸光度值，并計算其亞硝酸鹽含量，然后按下式計算黑豆紅色素對亞硝酸鹽的體外清除率：

清除率（%）=[（A+C-B）/A]×100

式中：A為空白實驗反應液的亞硝酸鹽含量，B為加入黑豆紅色素反應液的亞硝酸鹽含量，C為用蒸餾水代替亞硝酸鈉標準溶液反應的反應液的亞硝酸鹽含量。

1.2.2.2 反應溫度 在10支25mL比色管中分別加入2.0mg/mL的黑豆紅色素溶液1mL，然后各加入1mL亞硝酸鈉標準溶液（200μg/mL），加入上一步試驗得出的最適pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液8mL，混勻后于20、30、37、40、50、60、70、75、77、80℃下反應1h。吸取1mL上述反應液，按照1.2.1的方法測定538nm處的吸光度值，并計算其亞硝酸鹽含量，然后按1.2.2.1中公式計算黑豆紅色素對亞硝酸鹽的體外清除率。

1.2.2.3 反應時間 在14支25mL比色管中分別加入2.0mg/mL的黑豆紅色素溶液1mL，然后各加入1mL亞硝酸鈉標準溶液（200μg/mL），加入上一步試驗得出的最適pH的醋酸緩沖溶液8mL，混勻后在上一步試驗得出的最適反應溫度下反應0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0h。吸取1mL上述反應液，按照1.2.1的方法測定538nm處的吸光度值，并計算其亞硝酸鹽含量，然后按1.2.2.1中公式計算出黑豆紅色素對亞硝酸鹽的體外清除率。

1.2.2.4 黑豆紅色素濃度 在12支25mL比色管中分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5mg/mL的黑豆紅色素溶液1mL，然后各加入1mL亞硝酸鈉標準溶液（200μg/mL），加入上一步試驗得出的最適pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液8mL，混勻后于上一步試驗得出的最適反應溫度下反應最適的時間。吸取1mL上述反應液，按照1.2.1的方法測定538nm處的吸光度值，并計算其亞硝酸鹽含量，然后按1.2.2.1中公式計算出黑豆紅色素對亞硝酸鹽的體外清除率。

1.2.3 黑豆紅色素與Vc對體外清除亞硝酸鹽作用的比較 取5支25mL比色管中分別加入0、4.0、4.5、5.0、 5.5mg/mL的黑豆紅色素和Vc溶液1mL，然后各加入1mL亞硝酸鈉標準溶液（200μg/mL），加入pH2.6磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液8mL，混勻后于37℃下反應4h。吸取1mL上述反應液，按照1.2.1的方法測定538nm處的吸光度值，并計算其亞硝酸鹽含量，然后按1.2.2.1中公式計算出對亞硝酸鹽的體外清除率。

1.2.4 數據處理與分析 每組試驗重復三次，所有數據在WPS表格中進行統計分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同pH值下黑豆紅色素對亞硝酸鹽體外清除作用的影響 由圖1得出，在研究的pH值范圍（2.6～4.6）內，黑豆紅色素對亞硝酸鹽的體外清除作用隨pH值的升高而減小，在pH2.6時，體外清除率最高，達到59.44%。這表明在環境條件為酸性，接近人體胃液的條件下，黑豆紅色素對亞硝酸鹽具有較高的體外清除作用。

2.2 不同反應溫度下黑豆紅色素對亞硝酸鹽體外清除作用的影響 由圖2得出，黑豆紅色素對亞硝酸鹽體外清除率隨反應溫度升高清除率逐漸升高，說明溫度對黑豆紅色素清除亞硝酸鹽有很大的影響。如果以人體內部為前提，盡量將溫度定在接近人體的溫度。由圖2可以看出，反應溫度在30～40℃，黑豆紅色素對亞硝酸鹽體外清除率基本變化不大，即可以參照人體的溫度，選取37℃進行后續的實驗。

2.3 不同反應時間下黑豆紅色素對亞硝酸鹽體外清除作用的影響 由圖3得出，黑豆紅色素對亞硝酸鹽的清除率隨著時間的延長而升高，反應時間從0.5～3.0h呈現一個明顯的增長趨勢，而后又稍微下降之后又再升高。當反應時間達到4h之后，清除率基本不再增長，維持在80%以下，說明最佳的反應時間為4h。

2.4 不同黑豆紅色素濃度對亞硝酸鹽體外清除作用的影響 由圖4得出，在不同的黑豆紅色素濃度下，黑豆紅色素濃度與對亞硝酸鹽的體外清除率呈正相關關系，清除率隨黑豆紅色素濃度增大而增大。黑豆紅色素濃度在0.5～2.5mg/mL增長明顯，在2.5～5.5mg/mL增長相對緩慢，在5.5mg/mL黑豆紅色素對亞硝酸鹽的體外清除率達到最高，清除率可達99.50%。

2.5 黑豆紅色素與Vc對亞硝酸鹽體外清除作用的比較結果 由圖5可以看出，隨著Vc的濃度的升高，其對亞硝酸鹽的清除率而增大，但在同樣條件下，黑豆紅色素有明顯的優越性。黑豆紅色素濃度為4.0mg/mL時，清除率達到94.24%，而Vc僅為59.48%；黑豆紅色素在最適濃度5.5mg/mL時對亞硝酸鹽的體外清除率達99.50%，Vc為80.14%。由圖5可以看出，濃度在4.5～5.5mg/mL，Vc的清除作用雖然明顯增強，但遠遠不及黑豆紅色素的清除效果。

3 結論

亞硝酸鹽經常被用于某些食品中以增強其商品性，但存在一定的食品安全風險。本研究通過對黑豆紅色素體外清除亞硝酸鹽的條件，如pH值、反應溫度、反應時間、黑豆紅色素濃度等進行優化，明確了不同條件對黑豆紅色素體外清除亞硝酸鹽的影響作用，并得到了最佳的清除條件，即：當黑豆紅色素濃度為5.5mg/mL時，在pH2.6下，反應溫度為37℃下反應4h，黑豆紅色素對亞硝酸鹽體外清除率達到99.50%。在同等條件下與Vc進行對照比較之后，發現黑豆紅色素有比Vc更好的體外清除效果。黑豆紅色素不僅可以作為食品添加劑用于食品著色，也可作為亞硝酸鹽體外清除劑使用。

參考文獻

[1]滕濤，李娟，陸靜，等.提取條件對橘皮醇提物在模擬胃液中清除亞硝酸鹽能力的影響[J].食品科技，2016，41（2）：255-258.

[2]黃俊生，張佩虹，陳曉鑾，等.半仿生下龍膽草體外清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究[J].韓山師范學院學報，2012（3）：49-53.

[3]朱艷芳，楊杰，劉東華，等.黃秋葵花體外清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究[J].食品與發酵工業，2014，40（11）：100-101.

[4]張素斌，李江峰.蟲草花水浸提液對亞硝酸鹽清除作用的研究[J].食品科技，2014，39（4）：181-184.

[5]劉鋼，賈冬英，趙甲元，等.石榴皮多酚提取物對亞硝酸鹽的體外清除作用研究[J].中國調味品，2016，36（2）：41-44.

[6]崔霖蕓.野木瓜提取液清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成研究[J].湖北農業科學，2014，3（10）：5504-5507.

[7]宋茹，韋榮編，胡金申，等.荔枝皮色素體外清除亞硝酸鹽作用研究[J].食品科學，2010，31（5）：104-107.

[8]梁巖冰，許麗娟，王治寶，等 .壩上油菜蜂花粉中多糖和乙醇提取物對亞硝酸鹽清除作用的研究[J].河北北方學院學報，2011，27（5）：33.

[9]李桂星，胡曉丹，孫紅男，等.模擬胃液條件下蘋果多酚對亞硝酸鹽的清除作用[J].食品科學，2011，32（11）：1-4.

[10]王金亭.天然黑豆紅色素的研究進展[J].中國食品添加劑，2010（3）：171-174.

[11]Baojun Xu，Sam K. C. Chang.Antioxidant Capacity of Seed Coat， Dehulled Bean， and Whole Black Soybeans in Relation to Their Distributions of Total Phenolics， Phenolic Acids， Anthocyanins， and Isoflavones.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（18）：8365-8373.

[12]滕學峰.黑豆皮中色素的提取純化、結構鑒定及其性質的研究[D].哈爾濱：東北農業大學，2008.

[13]褚盼盼，靳澤榮，喬元彪.黑豆皮花青素不同提取方法及其體外抗菌活性研究[J].大豆科學，2015，34（4）：685-689.

[14]張芳軒，張名位，張瑞芬，等.不同黑大豆種質資源種皮花色苷組成及抗氧化活性分析[J].中國農業科學，2010，43（24）：5088-5099.

[15]褚盼盼，呂藝瑤，朱曉換，等.微生物發酵粗酶液酶解提取黑豆衣紅色素新工藝[J].食品科技，2015，40（6）：262-268.

（責編：張宏民）