乳頭管灌注LPS對家兔血液中NO和NOS含量的影響

袁曦 曹隨忠 楊齊

摘 要：目的：探討急性乳腺炎對家兔血液中一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合酶（NOS）活力的影響，為臨床治療家兔乳腺炎提供依據。方法：通過家兔乳頭管灌注LPS建立家兔乳腺炎模型，在灌注內毒素前后不同時間點分別測定健康家兔和患病家兔血清中NO的含量和NOS活力，判定乳頭管灌注LPS對家兔血液中NO含量和NOS活力的影響。結果：乳頭管灌注LPS之后，有明顯的體溫變化，乳房先稍有腫脹，12h后變紅腫，48h變堅硬，5d硬度下降。NO含量和NOS活力均在灌注LPS后上升并在6h達到最高值，NO含量在24h時開始下降，72h時基本下降到接種前水平；NOS活力在12h開始下降，48h時又開始增加。結論：乳頭管灌注LPS對家兔血液中NO含量和NOS活力有影響，NO和NOS在乳腺炎的發展過程中有一定的作用，為臨床治療提供理論依據。

關鍵詞：LPS；家兔；NO；NOS

中圖分類號 S858.291 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）19-0085-04

Abstract：[Objective]To explore the effect of acute mastitis on nitric oxide （NO） content and nitric oxide synthase （NOS） activity in rabbit blood ， provide the basis for clinical treatment of mastitis.[Methods]Through the rabbits nipple tube perfusion LPS to establish rabbit mastitis model.at different time pointsbefore and after the infusion of endotoxin，determination of NO content and NOS activity in serum of healthy and diseased rabbits，to determine the effect of nipple tube perfusion LPS on NO content and NOS activity in rabbit blood.[Results]NippletubeafterLPSinfusion， showing significant changes in body temperature，Breast to slightly swollen， 12 hours later become inflamed，48hours become hard，5 days later decreased hardness，NO content and NOS activity were increased after LPS perfusion，And reached the highest value in the 6 hours，NO content began to decline in 24 hours，dropped to the level before vaccination in 72 hours；NOS activity began to decline in 12 hours，began to increase again in 48 hours.[Conclusion]Nipple tube perfusion LPS on rabbit blood NO content and NOS activity， NO and NOS have a certain role in the development process of mastitis， providing a theoretical basis for clinical treatment.

Key words：LPS；Rabbits；NO；NOS

乳腺炎又名乳房炎，是當今世界各國奶牛業中最常見也是造成經濟損失最嚴重的疾病之一。奶牛患上乳腺炎后，不僅會影響牛奶的產量，降低牛奶的品質，還易延長產后發情和妊娠的時間，甚至使病牛失去生產性能，使處于產奶高峰期的奶牛過早被淘汰，給奶牛行業帶來了巨大的經濟損失[1]。乳腺炎主要是由多種非特定的病原微生物引起，目前已發現約有130多種，常見的有23種，其中細菌14種，霉形體2種，真菌及病毒7種，給乳腺炎的防治帶來了很大的困難[2]，其中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是最常見的分離菌株。脂多糖（LPS）作為革蘭氏陰性菌的細胞壁的主要成分，是導致炎癥和感染的重要原因。炎癥、感染、創傷后早期，病變部位的血管包括微循環血管中即出現白細胞黏附現象。黏附的白細胞釋放炎癥介質、活性氧等，使組織損傷加重[3]。NO參與炎癥反應，作用比較復雜，有廣泛的生物活性[4]。

一氧化氮（NO）是一種由血管內皮細胞分泌的內源性血管舒張因子[5]。一氧化氮為氣體自由基，易于氧分子、超氧自由基等反應，在體內極不穩定，生物半衰期短，只有3～5s，微溶于水，具有親脂性，能透過生物膜擴散，發揮信息功能[6]。NO在生物體內主要由一氧化氮合酶催化合成，在NADPH和/或BH4存在的條件下，NOS催化L-精氨酸末端胍基中的一個氮原子和氧分子反應生成NO和胍氨酸[7]。NO在循環系統中有著廣泛的生理作用：血管內皮釋放的NO通過升高血管平滑肌cGMP水平，使血管平滑肌松弛，引起血管擴張，血壓下降，調節血管張力等；NO抑制淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞及血小板凝集和黏附到內皮細胞上；NO對血管通透性的影響與血管的性質有關，在大血管中降低通透性，在微血管中則促進[8]。

一氧化氮合酶（NOS）包括三個酶家族，神經元型一氧化氮合酶（NOS-Ⅰ），誘導型一氧化氮（NOS-Ⅱ）和內皮一氧化氮合酶（NOS-Ⅲ），神經元內和內皮細胞內的一氧化氮合酶統稱結構型一氧化氮合酶（TNOS）[9]。TNOS可源源不斷的產生，而iNOS只在受到感染或其他方面的刺激才產生。NOS可以催化L-精氨酸生成氨甲酰鳥氨酸，同時伴隨著NADPH的氧化，從而生成游離的NO[10]。微量LPS刺激成纖維細胞可引起細胞增殖，并增加細胞內誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達[11]。

本研究通過乳頭管灌注LPS建立家兔急性乳腺炎模型[12，13]，測定乳腺炎發展過程中NO含量和NOS活性，根據其變化，探究乳腺炎過程中NO和NOS的作用，為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 5只健康的懷孕15d左右的家兔（購于四川省名山縣），均為初產兔，體重4.0kg左右，常規飼養。

1.1.2 試驗試劑 試劑盒：一氧化氮試劑盒、一氧化氮合酶試劑盒（均購于南京建成生物試劑研究所）。藥品：大腸桿菌內毒素（Sigma公司）、滅菌生理鹽水、75%酒精。

1.1.3 試驗儀器 Varioskan 酶標儀（Thermo公司，美國）、血常規檢測儀、注射器、頭皮針、EP管、真空采血管、移液槍、96孔板、溫度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 LPS灌注液的配制及灌注方法 LPS（Sigma公司）由O55：B5血清型大腸桿菌分離提純，滅菌生理鹽水配成1mg/mL，-20℃避光保存備用。灌注LPS劑量按150μg/kg體重劑量從第三對乳腺乳頭管注入。灌注LPS之前的泌乳母兔作為對照組，灌注LPS之后的為實驗組。母兔分娩后仔兔自然哺乳，于第7天將母兔與仔兔分離。用75%的酒精對第三對乳腺區域進行消毒，然后用1mL的注射器輕輕刺破皮膚沿乳頭管插入，注入一定量的LPS。

1.2.2 血樣的采集 采血的時間點為灌注LPS之前2h，灌注后6h、12h、24h、48h、72h和5d。采集母兔耳緣靜脈血2mL，將全血分成2份，一份全血抗凝用于血常規的測定；另一份全血于2 000r/min離心15min分離血清，-20℃保存，用于血清NO含量和NOS活力的測定。

1.2.3 測試指標及方法

1.2.3.1 體溫的測定 在采血時間點灌注LPS前2h，灌注后6h、12h、24h、48h、72h和5d，在采血前測直腸體溫，并觀察乳房局部變化。

1.2.3.2 血清一氧化氮NO含量測定 采用硝酸還原酶法，按南京建成生物工程研究所提供的NO試劑盒說明測定。

1.2.3.3 血清一氧化氮合酶（NOS）活力的測定 采用顯色反應法，按南京建成生物工程研究所提供的NOS測定試劑盒說明測定。

1.2.3.4 母兔血液白細胞（WBC）、淋巴細胞（LYM）、單核細胞（MID）的總數的測定 每次采血后，用其中一份全血進行血常規檢測。

1.3 數據統計分析 在采血后立即做血常規檢測，NO和NOS的數據應用Excel 2003軟件整理，SPSS1 3.0軟件對所得數據進行一維方差分析、t檢驗，所有數據均用平均數±標注差（X±SD）表示，組間用t檢驗其差異顯著性[14-15]。

2 結果與分析

2.1 評價乳房炎模型指標的變化

2.1.1 母兔的體溫變化 母兔均在灌注LPS后6～12h內的溫度顯著高于對照組（P<0.05），12h時體溫均上升到41℃，分別于24h、48h時體溫恢復到對照組水平（圖1）。

2.1.2 母兔血液白細胞（WBC）、淋巴細胞（LYM）、中間細胞（MID）的總數動態變化 灌注LPS后6h，白細胞總數升高，72h后開始降低，到第5d是恢復到對照組水平（圖2）。淋巴細胞和中間細胞（包括單核細胞、嗜酸性細胞和嗜堿性細胞）在灌注LPS后6h總數逐漸降低，24h后逐漸升高，72h時恢復到對照組水平（圖3、圖4）。

2.2 NO含量和NOS活力的變化 乳頭管灌注LPS后，NO含量先稍有升高，24h時開始下降，72h時基本下降到接種前水平。NOS活力在6h時稍有上升趨勢，12h開始回降，48h時又開始增加（圖5、圖6、表1、表2）。

3 討論與結論

3.1 討論

3.1.1 對乳房炎模型的評價 乳房內注入內毒素后，動物體溫升高，乳房局部的臨床變化等全身癥狀是急性期病理反應的一種表現[16]。乳房局部變化先稍有腫脹，12h后變紅腫，48h變堅硬，5d堅硬降低。體溫的變化雖然不是乳房炎診斷的特征性指標，但可反應疾病發生時的全身反應。血液中炎性細胞總數的動態變化進一步證實乳房炎的發展過程及動物機體對灌注LPS后的反應及抵御能力。中性粒細胞增多常見于感染性疾病和一般炎性疾病，淋巴細胞減少見于中性粒細胞絕對增多的疾病，單核細胞減少見于急性傳染病的初期及各種疾病的垂危期[17]。本實驗中的乳房炎模型各指標的變化與文獻[1，10，12-13]中變化相同。

3.1.2 乳頭管灌注LPS對家兔血液中NO含量和NOS活力有影響 通過本試驗，乳頭管灌注LPS后，NO含量和NOS活力均在灌注后6h達到最高值，NO含量先稍有升高，24h時開始下降，72h時基本下降到接種前水平，灌注后6h與灌注前2h和灌注后12h差異顯著（P<0.05）。NOS活力在6h時稍有上升趨勢，12h開始回降，48h時又開始增加，灌注后6h與灌注前2h和灌注后12h差異顯著（P<0.05）。與文獻[5，18-19]報道相同。由試驗結果可見，血液中NO含量和NOS活力的變化對急性乳腺炎有一定的治療作用。NO是獨立存在于血管、巨噬細胞和神經系統中的生理性調節因子[20]。NO由NOS催化生成，適量NO可發揮舒張血管、抑制血小板凝集和黏附以及PMN的聚集等作用；還可彌散作用于突觸前、后膜上的受體，發揮神經信號傳遞功能；而過量NO可破壞酶活性，產生細胞毒作用。一氧化氮合酶（NOS）包括結構型一氧化氮合酶（TNOS）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS），TNOS可源源不斷的產生，而iNOS只有在受到感染或其他刺激是才產生[9]。在許多組織中NOS活性有其組織特異性，某一種組織以表達一種類型測同工酶為主，如神經元主要表達（NOS-Ⅰ），內皮細胞相對特異性地表達（NOS-Ⅲ）等[21]。內毒素可直接導致內皮細胞合成和釋放NO[22]。

微血管內皮細胞在炎癥反應中起著關鍵性的作用，可以激活白細胞，使進入組織的循環白細胞增加，并趨化白細胞到達炎癥部位。而血管內皮分泌的NO可以維持血管動態平衡，抑制白細胞貼壁，控制炎癥的發生和發展[23]。

NOS是生成NO的關鍵環節，一方面在結構型一氧化氮合酶（TNOS）的作用下參與生理性調節血管張力過程，另一方面它又在其他一些細胞因子的刺激下，激活誘導型一氧化氮合酶（iNOS），介導血管內皮細胞的損傷，參與機體的病理反應[24]。

通過本試驗結果可見，乳頭管灌注LPS后6h時NOS活力顯著升高，之后開始降低，48h時又有升高趨勢。乳頭管灌注LPS后，機體馬上做出反應，促使NOS的活性提高，NOS的活性提高之后可以催化產生更多的NO，一氧化氮生成量的增加可加快血流速度[22]，血流速度的加快，加快炎性物質的帶走，帶來更多的抗炎物質，有利于快速的抗炎。NO含量在6h與12h組間差異顯著，可見NO含量的升高速度很快，NO的含量在6h時達到最高值[19]，說明此時機體的抗炎達到最大程度，NO對急性炎癥有較大效果。NO達到一定含量是反而抑制了NOS的活力，使NOS的活力下降[8]。TNOS可源源不斷的產生，而iNOS只有在受到感染或其他刺激是才產生。至于乳頭管灌注LPS后機體所產生的NO主要由TNOS還是iNOS催化合成，還尚待探究。

3.2 結論 通過本試驗可得出，乳頭管灌注LPS造成家兔的急性乳腺炎后，家兔血液中NO含量和NOS活力明顯增加，隨著NO含量和NOS活力的變化，說明NO和NOS在乳腺炎的發展過程中有一定的作用。

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（責編：張宏民）