富硒蛹蟲草的篩選及其耐硒特征的研究

趙建英 賀瑩 邊小娜

摘 要：該文通過實驗篩選出一株發酵周期短、菌絲體產量及富硒量較高的優質菌株北冬蟲夏草1，研究冬蟲夏草的耐硒特征。結果表明，在搖瓶培養過程中，北冬蟲夏草的耐亞硒酸鈉濃度為12μg/mL時，其生物量達到12.01g/L，富硒量達到4.635μg/mL，富硒率達到385.92μg/g。研究富硒北冬蟲夏草的生長過程曲線，了解到當培養時間為72h左右時，其生物量最大且此時的富硒效果最好。

關鍵詞：北冬蟲夏草；亞硒酸鈉；硒含量測定；生長曲線

中圖分類號 TS213.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）19-0037-02

Abstract：The selenium- enriched Cordyceps was screened， and the mutant Cordyceps 1 was obtianded. Fermentation conditions were investigated，the concentration of sodium selenite resistant 12μg/ml.Under the optimized conditions， the selenium content of the cells was up to 12.01g/L，Se amount was up to4.635μg/ml， selenium-riched rate was up to 385.92μg/g. The growth curve of cordyceps shows when the incubation time was about 72h， the biomass is the largest and the effect of selenium- enriched is the best.

Key words：Cordyceps；Selenite；Determination of selenium content；Growth curve

北冬蟲夏草（蛹蟲草）生活史的有性階段包括菌絲體生長和子實體生長[1]。鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲幼蟲把蛹草擬青霉的孢子食入體內，還可以自由活動，即為“冬蟲”，當條件適宜時，孢子便萌發形成菌絲體，菌絲體吸取蟲蛹的營養作為其生長發育的物質和能源[2]。

硒是人體必需的微量元素之一，研究發現，硒尤其是有機硒具有預防心腦血管疾病、抗腫瘤、提高免疫力、促進人體生長發育等作用，人體缺硒會導致多種疾病。據硒鹽的毒理分析表明，無機硒均為劇毒，且不易被人體吸收，而有機硒化合物毒性遠低于無機硒化合物，且生物利用率高[3]。通過人工方法將無機硒轉化成有機硒，具有普遍的食用和保健價值。無機硒在蟲草體內通過菌絲細胞內物質的代謝，結合到大分子活性物質（如多糖和蛋白質）上，轉化為有機硒多糖和硒蛋白，從而發揮了硒和蟲草固有的以及協同的生理作用，使其具有無毒、安全、高效的生理活性，進而為開發天然的富硒蛹蟲草提供科學的理論依據[4]。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

1.1.1 菌種 供試蛹蟲草（Cordyceps militaris）為本實驗室保藏菌種，各菌株編號：蛹蟲草1，蛹蟲草2，蛹蟲草3。

1.1.2 試劑 土豆，黃豆，玉米粉（均購自同達森客超市）；葡萄糖，果糖，麥芽糖，蔗糖，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，硝酸銨，氯化銨，硫酸銨（均為分析純），蛋白胨，酵母粉，實驗室已具有。酵子：玉米面活性干酵母。

1.2 儀器與設備 KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯儀器公司），生化培養箱（上海躍進醫療器有限公司，型號 SPX-250），手提式蒸汽滅菌器（江陰濱江設備有限公司），超凈工作臺（上海智誠分析儀器制造有限公司，型號 ZHJH-C1112B），恒溫震蕩培養器（上海智誠分析儀器制造有限公司，型號ZWY-100D）。

1.3 蛹蟲草富硒菌株的選育 取0.2～0.3cm的三種菌種的組織塊分別接種到亞硒酸鈉發酵培養基，裝液量150mL/250mL，置于19℃、130r/min的恒溫培養振蕩器中震蕩培養72h，測定其發酵液中殘留無機硒（殘硒）的含量及其生物量[5]。

1.4 富硒蛹蟲草發酵液的制備 將三角錐瓶中培養的液體移入離心管中，稱重后等量對稱放置在臺式離心機中，以4 000r/min的轉速常溫離心30min，離心后的上清液即為發酵液[6]。

1.5 蛹蟲草生物量測定 采用干重法，將三角錐瓶中培養的液體移入離心管中，稱重后等量對稱放置在臺式離心機中，以4 000r/min的轉速常溫離心30min，傾去上清液，將固體放到稱量紙上，置于精密電熱恒溫鼓風干燥箱中，100℃烘干至恒重，稱量[7]。

1.6 硒標準曲線的繪制 參加文獻[8]。

1.7 發酵液中殘留無機硒（殘硒）含量測定 參加文獻[9]。

1.8 蛹蟲草耐硒實驗 參加文獻[10-11]。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草富硒菌株的選育

2.1.1 硒標準曲線的繪制 以亞硒酸鈉濃度為橫坐標，以420nm處的吸光值為縱坐標做圖，得硒標準曲線（圖1），其回歸線性方程為y=0.0070x-0.0050。

2.1.2 富硒菌株的選育 從表1可以看出，在指標生物量的考察中蛹蟲草1占優勢，在指標富硒量的考察中蛹蟲草1占優勢，在指標富硒率的考察中蛹蟲草1同樣占優勢。該實驗表明，在同等實驗條件下蛹蟲草1富硒效果最好。

2.2 蛹蟲草耐硒實驗 表2顯示了亞硒酸鈉濃度對蛹蟲草菌絲體的生長情況和富硒效果的影響。由表2可以看出，培養基中亞硒酸鈉濃度的高低會影響蛹蟲草的生長，隨著亞硒酸鈉濃度的增加，生物量呈下降趨勢。亞硒酸鈉有一定的毒性，當亞硒酸鈉濃度低于12μg/mL時，它的加入雖然會影響蛹蟲草的生長，但并不顯著。當亞硒酸鈉濃度超過14μg/mL時，蛹蟲草的生物量急劇下降，表明蛹蟲草在液體發酵培養基中耐硒濃度為12μg/mL。由表2還可以看出，隨著培養基濃度的增加，蛹蟲草菌絲體的富硒量越高，其富硒效果越好，然而當亞硒酸鈉濃度達到14μg/mL時，發酵液由淡黃色變為粉紅褐色，這可能是由于蛹蟲草將亞硒酸鈉轉化為單質硒而不是轉化為有機硒的緣故。當亞硒酸鈉的濃度較高時（超過14μg/mL后），盡管富硒率繼續增加，但富硒量與生物量已顯著下降，因此，蛹蟲草1搖瓶培養時的耐亞硒酸鈉最大濃度為12μg/mL，此時蛹蟲草1的生物量可以達到12.01g/L，富硒量達到4.635μg/mL，富硒率達到385.92μg/g。

2.3 蛹蟲草生長曲線實驗 圖2、3顯示了蛹蟲草生物量與富硒量隨培養時間變化的關系。由圖2、3可以看出，當蛹蟲草培養72h時，生物量與富硒量均達到最高值，培養時間從12h到72h，蛹蟲草的菌絲體生物量與富硒量逐漸增加，而72h之后菌絲體的生物量和富硒量急劇下降，此時菌絲體出現了明顯的萎縮、老化現象，而富硒量下降的原因還有待進一步研究。

3 結論

本文研究了蛹蟲草的耐硒特征，結果表明，在搖瓶培養過程中，蛹蟲草耐亞硒酸鈉濃度為12μg/mL時，生物量達到12.01g/L，富硒量達到4.635μg/mL，富硒率達到385.92μg/g。

參考文獻

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[4]鄧紅.食用菌栽培與加工技術[M].北京：中國輕工業出版社，2002.

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[10]邵偉，樂超銀，李玲.富硒香菇菌種原生質體誘變選育[J].食用菌，2004（2）：12-13.

[11]黃淵澤，殷國健，王光燦，等.富硒食用菌中的硒含量[J].云南大學學報（自然科學版），1997，19（4）：341-343.

（責編：張宏民）