基于中藥指紋圖譜結合模式識別的清開靈軟膠囊批次間穩定性控制研究

滕會會 杜守穎 李鵬躍 陸洋 白潔 武慧超 孫如煜 張晴 杜秋

基于中藥指紋圖譜結合模式識別的清開靈軟膠囊批次間穩定性控制研究

滕會會 杜守穎 李鵬躍 陸洋 白潔 武慧超 孫如煜 張晴 杜秋

目的 基于中藥指紋圖譜結合化學模式識別方法尋找影響清開靈軟膠囊批次間穩定性的重點化學成分。方法 采用聚類分析、主成分分析及偏最小二乘法模型對不同批次清開靈軟膠囊的高效液相色譜法指紋圖譜進行整體觀察和評價,找出可能與相似度強相關的標志物。結果

指紋圖譜; 化學模式識別; 清開靈軟膠囊

清開靈組方源于中醫治療急性熱病傳統處方“溫病三寶”中的安宮牛黃丸,具有清熱解毒、化痰通絡、醒神開竅之功效,臨床療效顯著[1-2]。現行的清開靈軟膠囊質量評價和控制還停留在幾個有效成分的定性和定量測定[3],由于中藥材或中藥制劑是通過內部各種化學成分間協同作用發揮藥效作用的,僅以其中個別或幾個“有效成分”作為質量評價標準,很難準確對中藥質量進行整體評價[4]。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的手段[5],但目前采用相似度評價,不能立體、多維地對中藥材及其制劑的質量進行整體分析,而化學模式識別能實現中藥多維信息的綜合分析,已廣泛應用于中藥材及中成藥的質量控制研究[6-10]。因此,本研究采用高效液相色譜法(high performance liqwid chromatography,HPLC)建立清開靈軟膠囊指紋圖譜,并用聚類分析、主成分分析(principal component analysis,PCA)及偏最小二乘法(partial leasr square,PLS)等化學模式識別對所得圖譜進行分析、解析,為全面控制清開靈軟膠囊的批次間的穩定性提供了方法。

1 儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀(LC-20AD泵,SIL-20A自動進樣器,SPD-M20A檢測器);分析天平(賽多利斯儀器系統有限公司);G20型醫用離心機(北京白洋醫療機械有限公司);KQ5200DA型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110715-201318);甲醇、乙腈(Fisher公司,色譜純);磷酸(TED公司,色譜純);哇哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司);清開靈軟膠囊(批號: 14072411、15052042、15051641、15051941、15051841、15051942、15052041、15052241、15051741、15052111、15052141,每粒0.4 g,含黃芩苷20 mg)。

2 實驗方法與結果

2.1 清開靈軟膠囊指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件 Phenomenex Luna RP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相(A)0.4%磷酸的水溶液-(B)甲醇-乙腈(體積比為4∶1),梯度洗脫;流速1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長254 nm;進樣量為5 μL。梯度洗脫程序:0～15分鐘,5%～30%B; 15～22分鐘,30%～35%B;22～40分鐘,35%～60% B;40～43分鐘,60%B;43～55分鐘,60%～81%B; 55～60分鐘,81%～90%B;60～65分鐘90%B。

2.1.2 溶液的配制 黃芩苷對照品溶液的配制:稱量黃芩苷對照品適量,加70%甲醇超聲溶解,配制成含黃芩苷100 μg/mL的對照品溶液。軟膠囊供試品的制備:取1.2 g硅藻土置于蒸發皿中,精密稱定,再取軟膠囊內容物0.4 g,精密稱定于上述蒸發皿中,研勻后,將其全部轉入錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲70分鐘(功率200 W,頻率40 KHz),再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,吸取5 mL以10000 rpm離心10分鐘,上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾,取續濾液,即得。

2.1.3 指紋圖譜分析方法及數據處理方法 中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)進行指紋圖譜分析,多元數據分析和建模由SIMCA-P 11.5軟件及SPSS 16.0來完成。

2.1.4 清開靈軟膠囊指紋圖譜方法學考察 (1)精密度考察:取同一批號供試品溶液,連續進樣6次,結果各共有峰相對保留時間的RSD均＜1.3%,相對峰面積的RSD均＜2.8%,表明儀器精密度良好,符合指紋圖譜要求。(2)穩定性考察:取同一供試品溶液,分別于0、2、4、6、12、24小時進樣檢測,結果各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.12%,相對峰面積的RSD均＜3%,其相似度均大于99%,表明供試品溶液在24小時內穩定性良好,符合指紋圖譜研究技術的要求。(3)重現性考察:取同一批號供試品6份,按2.1.2項下對應的方法制備各供試品,分別進樣檢測,結果各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.12%,相對峰面積的RSD均＜2.7%,其相似度均大于99%,表明方法具有較好的重復性,符合指紋圖譜的要求。(4)樣品測定:取11批清開靈軟膠囊,分別按2.1.2項下制備各供試液并按2.1.1項下色譜條件進樣檢測,并用中藥指紋圖譜相似度計算軟件進行分析,以黃芩苷色譜峰作為參照峰,其保留時間為38.395分鐘,標示出了清開靈軟膠囊

21個共有峰(如圖1),共有峰面積所占總面積比例為87.42%,相似度均為1。(5)相似度評價:由于清開靈軟膠囊經HPLC檢測所得色譜圖中,黃芩苷色譜峰面積過大,峰高與其他峰高差異太大,因此考慮將其剔除后再計算相似度,保證相似度的準確性。結果所得11批次清開靈軟膠囊的相似度為0.994、0.993、0.995、0.992、0.92、0.998、0.992、0.994、0.989、0.992、0.976。

圖1 11批清開靈軟膠囊指紋圖譜

2.2 基于化學模式識別方法對不同批次清開靈軟膠囊進行整體性評價

前期實驗得到清開靈軟各自批次間的相似度均較高,但剔除黃芩苷與不剔除黃芩苷后所得兩者的相似度差異明顯,為了所得相似度的準確性,在接下來實驗中進行模式識別分析,結合清開靈軟膠囊11個樣本批次的整體聚集,分散情況得到更符合實際情況的相似度,并通過PLS模型分析相似度與變量之間的關系找到與相似度有密切聯系的化學成分。

2.2.1 系統聚類分析 將清開靈軟膠囊指紋圖譜數據經歸一化處理后進行聚類分析,采用Ward法(Ward’s Method),利用平方Euclidean距離(Squared Euclidean distance)作為樣品的測度進行分析。結果見圖2,聚類分析將11批樣品分為4類。樣本中S1、S7、S10、S6、S9為第Ⅰ類,S3、S8、S2、S4為第Ⅱ類,S11為第Ⅲ類,S5在第IV類,這四大類又繼續分成更小的類別,其中Ⅰ類分為A類和B類,說明在同一類別里S9與S1、S7、S10、S6相差較遠,Ⅱ類分為C類和D類,說明S4與S3、S8、S2在同一類別里相差較遠,結果表明,在劑型一致的前提下,不同批號的清開靈制劑樣品存在差異。由剔除黃芩苷后相似度結果,S5相似度為0.92,S11為0.976,在11批樣品中相似度最低,S1、S7、S10、S6、S9相似度分別0.994、0.992、0.992、0.998、0.989,S9相似度最低,S3、S8、S2、S4的相似度為0.995、0.994、0.993、0.992,S4的相似度最低,這與聚類分析分類結果一致。

圖2 聚類分析

2.2.2 PCA分析 通過將清開靈軟膠囊指紋圖譜數據經歸一化處理后導入SIMCA-P中,得4個主成分PCA模型,如圖3所示,模型的R2X為89.8%, Q2Y為67.9%,解釋度很高,符合實驗要求。分別繪制出得分圖及其3D圖(圖4)、PCA得分與載荷匯總圖(圖5)。

圖3 PCA主成分參數

由圖4可看出,樣品點在四個象限存在離散的情況,即不同批次樣品在處理后經HPLC測定的結果之間還是存在一定的差異,進一步分析樣本分布情況,S1、S6、S7、S10在右下第四象限高度聚集在一起,S2、S3、S4、S8在第三象限分布較近,S5、S9、S11分布在中上部分,距離較遠。這與剔除黃芩苷后所得相似度大小規律相一致,所得結果與聚類分析一致,說明黃芩苷由于峰過高過大,會對相似度計算的準確性有一定的影響,將其剔除后相似度結果比較符合實際情況。

圖4 PCA得分圖(上)及其3D圖(下)

由圖5可見,樣本可分為右下,左下及中上三部分。中上部分的S5、S9、S11相似度為0.92、0.989、0.976,而右下及左下部分的S1、S2、S3、S4、S6、S7、S8、S10相似度均大于0.99,且樣本S1、S6、S7、S10在右下部分高度聚集在一起,即樣品的相似度從右下至左上存在遞減的趨勢。而通過載荷分析,每個象限的變量分布不一樣,為了尋找對批次間相似度影響較大的化合物,擬以相似度作為Y變量,進行PLS分析。

2.2.3 基于PLS的重點化學成分篩選 通過將清開靈軟膠囊指紋圖譜數據導入SIMCA-P中,峰面積為X矩陣,相似度為Y變量,進行PLS分析。得3個主成分,如圖6所示。PLS模型的R2X為0.826, R2Y為0.997,Q2為0.953,能夠解釋82.6%的X變量,解釋99.7%的Y變量,交叉有效性為95.3%;解釋指標及預測指標均較高,模型擬合較好。分別繪制出預測值與觀測值擬合曲線圖(圖7)、載荷圖(圖8)、各化合物系數圖(圖9)、和各化合物VIP值圖(圖10),考察與相似度(Y)聯系密切的樣品或化學成分。

圖5 PCA得分與載荷匯總圖

圖6 PLS模型主成分參數

由圖7可見PLS模型的預測值與觀測值基本一致,R2=0.9969,RMSEE=0.0015,模型擬合較好,能夠很好的通過模型預測Y。

圖7 PLS模型中預測值與觀測值擬合曲線

圖8可得,峰號77、5、82、19、3、74、56、51、79、88、34、63、39共13個化學成分與Y分布最近,呈正相關;峰號99、4、29、50、15、17、18、35與Y距離最遠,呈負相關。由圖9、10可得,13個化學成分的系數及VIP值均大于1,較其他成分高,說明這13個峰對應的化學成分對軟膠囊相似度貢獻較大。通過將這13個成分的第一主成分loading值、系數分布及vip值(閾值＞1)相關參數總值|r|對比,再結合色譜峰比對、與相似度進行相關性分析(SPSS 16.0, Pearson Correlation Coefficients),篩選出3個化合物,結果見表1。由表可知,峰號82、19、77總值|r|均大于1.6,色譜峰比對得到相應保留時間,相關性分析參數R值均大于0.8,P值均小于0.05,說明該3個化合物與相似度存在較強的相關性,最終確定峰號82、19、77共3個化學成分為與相似度密切相關的潛在標志物,其中82號峰對應的化學成分為黃芩苷。

圖8 PLS載荷圖

圖9 PLS中各化學成分的系數結果

圖10 PLS中各化合物的VIP值

表1 軟膠囊相似度潛在標志物相關參數表

3 討論

本實驗中應用了系統聚類分析和主成分分析法兩種化學計量學方法分別對清開靈軟膠囊指紋圖譜色譜數據進行了模式識別的初探,經過分析與比較得到如下結論:兩種分析方法均將樣品分為四類,從整體分類效果上來看,主成分投影法更為直觀,能一目了然地看出各個分類樣本之間的聚類關系,聚類分析法則能體現出分類樣本間內在的相互聯系,兩種分析結果基本一致,可見,聚類分析與主成分分析方法可以互相佐證,為可信的數據分析方法。

目前指紋圖譜的評價以相似度作為門檻,而多數學者認為指紋圖譜中峰面積大及峰高較高的峰會對相似度的準確性有一定的影響,但該方面的研究報道卻很少。本實驗通過系統聚類分析和主成分分析兩種方法分析樣本的聚集、分布情況,得到清開靈軟膠囊11個批次樣本分布存在離散情況,說明各個批次之間存在一定的差異,其相似度不可能均在1左右;進一步分析樣本聚集情況,發現其與剔除黃芩苷后相似度的大小規律相接近,因此得出剔除黃芩苷后所得相似度更符合實際情況。

實驗中,由PCA分析得到樣品的相似度從右下至左上存在遞減的趨勢。通過載荷分析,發現每個象限的變量并不是均勻分布,說明變量與相似度之間也可能存在某種聯系,因此進一步通過PLS模型分析,建立相似度與變量之間的關系,找出與相似度密切相關的標志物,最終得到3個標志物。其中一個標志物為黃芩苷,已列入藥典質量限定范圍,提示有必要將其它未列入質量限定范圍標志物列入質控標準。

本實驗采用化學模式識別技術成功地對清開靈軟膠囊HPLC指紋圖譜進行了初步研究,該分析及數據處理方法能實現清開靈軟膠囊指紋圖譜的整體分析,不僅建立了清開靈軟膠囊指紋圖譜,驗證了峰面積大及峰高較高的峰確實會對相似度的準確性有一定的影響,同時找出了與相似度強相關的標志物,說明該方法能運用于中藥及中藥材的批次間穩定性的控制研究。由于時間原因,未對其他標志物進行結構鑒定,筆者團隊后續將會進行深入研究。

[1] 唐卡毅.清開靈軟膠囊臨床應用與研究新進展[J].現代中西醫結合雜志,2009,18(12):1444-1447.

[2] 陳榮,李云委.清開靈臨床應用概況[J].江西中醫學院學報,1995,7(1):42-44.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2015:1526-1528.

[4] 梁逸曾,易倫朝,黃熙,等.中藥分析新思路及其質量控制[J].分析測試學報,2014,33(2):119-126.

[5] 孫磊,喬善義,趙毅民.中藥指紋圖譜應用研究進展[J].國際藥學研究雜志,2009,36(3):194-197,203.

[6] 徐小娜.中藥色譜指紋圖譜研究及化學計量學方法的應用[D].長沙:中南大學,2010.

[7] 黎陽,劉素香,張鐵軍,等.枳實的高效液相色譜指紋圖譜研究[J].中草藥,2009,40(9):1469-1474.

[8] 劉瀟瀟,周穎儀,楊立偉,等.清開靈系列制劑的氨基酸色譜指紋圖譜[J].中成藥,2014,36(12):2537-2542.

[9] Liu Z H,Ting xiang Y E,Zhao H Z,et al.Fingerprint and chemical patternrecognitionmethodforqualitycontrolof Huoxiang Zhengqi liquid[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis,2012,32(11):2064-2067.

[10] Song X M,Yang X J,Wang W,et al.HPLC Fingerprint and Chemical Pattern Recognition of Rhizoma Panacis Majoris[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2011,17(11):59-62.

Based on fingerprint combined with chemical pattern recognition for stability control study between different batches of Qingkailing soft capsules

TENG Hui-hui,DU Shou-ying,LI Peng-yue,et al. School of Chinese Pharmacy,Beijing University of TCM,Beijing 100102,China

DU Shou-ying,E-mail:dushouying@263.net

Objective Based on fingerprint combined with chemical pattern recognition method for Qingkailing soft capsule on the stability of key chemical composition between different batches.Methods Cluster analysis,PCA and PLS model were used for observation and evaluation of different batches of soft capsules on the HPLC fingerprint,markers associated with similarity were identified.Results The system clustering analysis and principal component analysis showed that after eliminating chromatographic peak of baicalin similarity calculation the results was more in line with the actual situation.The PLS analysis was got 3 chemical component that was closely related to the similarity.The three compounds can be used as a

Fingerprint; Chemical pattern recognition; Qingkailing soft capsules

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.11.010

2015-06-23)

(本文編輯:董歷華)

北京市科技新星計劃(xx2015A048)

100102 北京中醫藥大學中藥學院[滕會會(碩士研究生)、杜守穎、李鵬躍、白潔、陸洋、武慧超、孫如煜(碩士研究生)、張晴(碩士研究生)、杜秋(碩士研究生)]

滕會會(1988-),女,2013級在讀碩士研究生。研究方向:中藥中藥新劑型與新技術研究。E-mail:h15810377850@163.com

杜守穎(1960-),女,博士,教授,博士生導師。研究方向:中藥新劑型與制劑關鍵技術。E-mail: dushouying@263.net

通過系統聚類分析及主成分分析表明剔除黃芩苷色譜峰后的相似度計算結果更符合實際情況;經偏最小二乘法分析得到3個化學成分與相似度密切相關,該3個化合物可作為控制清開靈軟膠囊批次間穩定性的重點化學成分。結論 該中藥指紋圖譜-化學模式識別方法用于中藥不同批次間穩定性控制研究是可行的。

key of chemical composition which influenced the stability of soft capsule between different batches. Conclusion The TCM fingerprint and chemical pattern recognition method is feasible for traditional Chinese medicine(TCM)between different batches stability control research.