小青龍湯聯合玉屏風散對變應性鼻炎大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB表達的影響

馬巖 王金昌 王樹鵬

小青龍湯聯合玉屏風散對變應性鼻炎大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB表達的影響

馬巖 王金昌 王樹鵬

目的 基于NF-κB信號通路觀察小青龍湯聯合玉屏風散對變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)大鼠鼻黏膜AQP5、NF-κB p65和p-CREB表達的影響,揭示小青龍湯聯合玉屏風散治療AR的作用機制及以飲論治AR的合理性。方法 將清潔級健康雄性Wistar大鼠48只隨機分為6組,即分為正常組、AR模型組、Forskolin干預組、H89干預組、PDTC干預組、小青龍湯聯合玉屏風散組,每組8只。采用卵蛋白全身致敏與局部攻擊方法制作AR大鼠模型,觀察小青龍湯聯合玉屏風散組在治療后鼻黏膜AQP5、NF-κB p65和p-CREB的表達。結果 模型組AQP5、p-CREB表達下調; Forskolin干預組、PDTC干預組、小青龍湯聯合玉屏風散組均能使AQP5、p-CREB表達上調,而cAMP依賴蛋白激酶(protein kinase A,PKA)抑制劑H89能下調AQP5、p-CREB表達。模型組NF-κB p65表達上調,Forskolin干預組、PDTC干預組、小青龍湯聯合玉屏風散組均能使NF-κB p65表達下調,而PKA抑制劑H89能上調NF-κB p65表達。結論 小青龍湯聯合玉屏風散治療變應性鼻炎作用機制可能與抑制NF-κB信號通路和興奮cAMP-PKA信號通路使AQP5表達上調有關,為以飲論治AR奠定了現代生物學基礎。

變應性鼻炎; 小青龍湯; 玉屏風散; NF-κB信號通路; cAMP-PKA信號通路

變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是臨床上的常見病、多發病。據統計,其在全球發病率約為25%～35%[1],部分地區甚至高達44.2%[2]。AR發病率呈現逐年上升的趨勢,嚴重影響了患者的生活質量,己經成為影響人類健康的全球性問題之一。AR發作時會流大量清水涕,此癥狀與中醫學“飲”的特點相似,而“飲”的生成又與肺脾腎三臟陽氣虛弱密不可分[3],故從“陽氣虛弱,水飲內停”立論,基于NF-κB信號通路,探討“以飲論治”AR生物學基礎研究,為“以飲論治”變應性鼻炎提供實驗理論依據,進一步證實中醫“以飲論治”的科學性。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級健康雄性Wistar大鼠48只,體質量為200～240 g,由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供。合格證號:SCXK(遼)2010-0001。動物的一般狀態好,鼻周無分泌物、無抓撓鼻現象、無噴嚏,皮毛光滑,活動及飲食正常,飼養于遼寧中醫藥大學動物實驗中心,濕度適宜,室內通風及光線良好。飼料為標準動物飼料,由動物室提供。

1.2 藥品與試劑

卵白蛋白:上海化學試劑廠,批號:20130108;卵白蛋白:上海化學試劑廠,批號:20130108。

抗原佐劑混懸液的組成:含卵白蛋白1 mg、氫氧化鋁凝膠50 mL;核蛋白提取試劑盒(批號:BB-3166),購自上海邦奕生物科技有限公司;AQP5抗體(批號:bs-1554R),購自北京博奧森生物技術有限公司;p-CREB抗體(批號:bs-5270R),購自北京博奧森生物技術有限公司;HRP標記的二抗(批號: bs-0295G-HRP),購自北京博奧森生物技術有限公司;PVDF膜,購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白marker,購自frements生產;Forskolin(批號:S1612),購自碧云天生物技術研究所;H89(批號:S1582),購自selleck生產。PDTC(批號:S1808),購自碧云天生物技術研究所;NF-κB p65抗體(批號:bs-20160R),購自北京博奧森生物技術有限公司; β-actin抗體(批號:bs-0061R),購自北京博奧森生物技術有限公司;Histone H2A抗體(批號:bs-3781R),購自北京博奧森生物技術有限公司;ECL發光試劑盒、SDS-Page凝膠試劑盒和總組蛋白提取試劑盒均購于碧云天生物。

1.3 分組和造模

將大鼠按體重采用隨機區組法分為6組,即分成正常對照組、AR模型組、Forskolin干預組、H89干預組、PDTC干預組、小青龍湯聯合玉屏風散組,每組8只。按照劉建國等[4]對變應性鼻炎大鼠模型建造,采用卵蛋白全身致敏與局部攻擊方法制作AR大鼠模型。除正常對照組外,各組以5%卵蛋白混懸液致敏,腹腔注射,1次/天,共7次;正常對照組:以等量生理鹽水替代5%卵蛋白混懸液,方法和步驟同實驗組。除正常對照組外,各組于第15天起,用5%卵蛋白混懸液100 μL雙側滴鼻,每側50 μL,1次/天,共7次;正常對照組:以等量生理鹽水替代5%卵蛋白混懸液,方法和步驟同實驗組。

癥狀分級標準:鼻癢計分,輕擦鼻幾下(＜5)計1分;抓撓鼻面不止,到處擦(5～10),計2分;抓撓鼻面不止,到處擦(＞10)計3分;噴嚏計分,1～3個計1分,4～10個計2分,11個以上計3分;鼻涕計分,流到鼻前孔計1分,超過鼻前孔計2分,流涕滿面計3分。記錄時以疊加記總分,總分超過5分者為模型成功。觀察時間為給藥后30分鐘。

1.4 給藥

按照《藥理實驗方法學》人與動物等效劑量換算方法,人與大鼠藥物每公斤體重劑量之比約為1∶6,因此各組藥物灌胃劑量如下:(1)正常對照組:按照每100 g大鼠體質量予以1 mL生理鹽水灌胃;(2)模型組:同正常對照組;(3)Forskolin干預組:按按5 mg/(kg·d)腹腔注射;(4)H89干預組:按按5 mg/(kg·d)腹腔注射;(5)PDTC干預

組:按50 mg/(kg·d)腹腔注射;(6)小青龍湯聯合玉屏風散組:按每1 kg大鼠體重予以8.4 mL所試藥物煎劑(相當于8.4 g生藥)灌胃。每天灌胃1次。

1.5 噴嚏、鼻抓癢計數

在處死前,給予5%卵蛋白混懸液100 μL滴鼻,觀察30分鐘并計數。鼻涕計分:在處死前,給予5%卵蛋白混懸液100 μL滴鼻,觀察30分鐘并計分。

1.6 取材

大鼠于最后1次灌胃后,腹腔注射1%苯巴比妥(40 mg/kg)麻醉,斷頭處死大鼠,同時取外周血,靜置,3000 rpm,離心5分鐘,取上清于凍存管中,-80℃存放備用。鼻背正中切開,迅速取出鼻中隔和鼻腔外側壁呼吸區粘膜組織,黏膜組織迅速投入4%中性多聚甲醛溶液中(PH值約7.2)中,4℃固定過夜,雙蒸水沖洗25分鐘,存放于75%乙醇溶液, 4℃保存。

1.7 檢測指標

應有Western blotting檢測核轉錄因子κB p65 (nuclear transcription factor κB p65,NF-κB p65)表達、磷酸化cAMP應答元件結合蛋白(phosphorylated cAMP response element binding protein,p-CREB) (Ser133)表達、水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)表達,具體操作方法按照說明書進行。抗體的稀釋比例:AQP5多克隆抗體l:200、p-CREB(Ser133)單克隆抗體1∶500、β-actin多克隆抗體1∶1000、Histone H2A-1多克隆抗體1∶300、β-actin多克隆抗體1∶250。

1.8 統計學處理

實驗數據采用SPSS 18.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示,各組數據均符合正態分布,且方差齊,故多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療后各組大鼠行為學指標比較

模型組與正常對照組相比較有顯著性差異(P＜0.05),說明變應性鼻為大鼠造模成功。與模型組相比較,Forskolin干預組、PDTC干預組、H89干預組鼻和小青龍湯聯合玉屏風散組大鼠在治療后抓癢次數、噴嚏次數以及鼻涕計分均有所下降,差異均有統計學意義(P＜0.05)。Forskolin干預組、PDTC干預組與小青龍湯聯合玉屏風散組比較無顯性差異(P＞0.05),H89干預組與小青龍湯聯合玉屏風散組比較有顯性差異(P＜0.05),見表1。

表1 變應性鼻炎大鼠行為學指標改變次數與計分(±s)

表1 變應性鼻炎大鼠行為學指標改變次數與計分(±s)

注:與正常對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與小青龍湯聯合玉屏風散組比較,cP＜0.05。

鼻抓癢次數噴嚏次數鼻涕計分正常對照組組別n 84.1±1.52.4±0.91.1±0.4模型組831.4±3.7a18.5±3.6a2.8±0.5aForskolin干預組84.9±1.8b3.0±0.8b1.5±0.5bH89干預組834.8±3.3bc23.3±2.9bc2.9±0.4cPDTC干預組84.9±1.5b3.4±0.9b1.4±0.5b小青龍湯聯合玉屏風散組84.5±1.5b2.8±0.7b1.3±0.5b

2.2 治療后各組大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB表達量的比較

與正常對照組比較,模型組AQP5相對蛋白表達量顯著降低,差異具有統計學意義(P＜0.01); H89干預組AQP5相對表達量與模型組相比較顯著降低(P＜0.01)。Forskinlin干預組、PDTC干預組、小青龍湯合玉屏風治療組AQP5相對蛋白表達量與模型組相比較顯著升高,差異有統計學意義(P＜0.01)。Forskolin干預組、PDTC干預組與小青龍湯聯合玉屏風散組比較無顯性差異(P＞0.05),H89干預組與小青龍湯聯合玉屏風散組比較有顯性差異(P＜0.01)。

模型組NF-κB p65相對蛋白表達量較正常組顯著升高,差異具有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較,H89干預組NF-κB p65表達量升高(P＜0.05), Forskinlin干預組、PDTC干預組、小青龍湯聯合玉屏風治療組NF-κB p65表達量顯著降低(P＜0.01)。Forskolin干預組、PDTC干預組與小青龍湯聯合玉屏風散組比較無顯性差異(P＞0.05),H89干預組與小青龍湯聯合玉屏風散組比較有顯性差異(P＜0.01)。

與正常對照組比較,模型組p-CREB(Ser133)相對蛋白表達量顯著降低,差異具有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較,H89干預組p-CREB (Ser133)表達量顯著降低(P＜0.01),而Forskinlin干預組、PDTC干預組、小青龍湯聯合玉屏風治療組p-CREB(Ser133)相對蛋白表達量顯著升高(P＜0.01)。Forskolin干預組、PDTC干預組與小青龍湯聯合玉屏風散組比較無顯性差異(P＞0.05), H89干預組與小青龍湯聯合玉屏風散組比較有顯性差異(P＜0.01)。見表1、圖1。

表2 治療后各組大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB相對表達量比較(±s)

表2 治療后各組大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB相對表達量比較(±s)

注:與正常對照組比較,aP＜0.01;與模型組比較,bP＜0.01;與小青龍湯聯合玉屏風散組比較,cP＜0.01。

B p65p-CREB正常對照組組別nAQP5NF-κ 80.66±0.060.00±0.000.66±0.05模型組80.31±0.04a0.66±0.05a0.43±0.06a Forskolin干預組80.63±0.05b0.60±0.08b0.65±0.04bH89干預組80.23±0.02bc0.72±0.03bc0.23±0.05bcPDTC干預組80.65±0.04b0.58±0.04b0.67±0.05b小青龍湯聯合玉屏風散組80.60±0.04b0.57±0.05b0.62±0.05b

圖2 治療后各組大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB在鼻黏膜的相對表達量

3 討論

3.1 AQP5與變應性鼻炎

腺體過度分泌是AR最基本病理特征之一,臨床表現多為鼻腔大量清水涕,嚴重影響人們的工作與生活質量。研究AR過度分泌性的機制和如何有效地控制腺體的過度分泌是當前AR研究的重點之一。AQP5可能參與氣道液體分泌的過程,同時還是腺體上皮細胞腔膜面水轉的限速屏障。在本實驗中模型組AQP5的表達下調,說明AQP5是變應性鼻炎發病環節之一,水通道蛋白對維持人體的生理狀態的作用十分重要[5]。有研究資料表明,水通道蛋白在體內液體轉運和分泌方面發揮著重要的作用。隨著對體內各系統水通道蛋白的深入研究,鼻腔黏膜水通道蛋白的分布、調節及生理學意義也逐漸清晰,其中AQP5與氣道內液體轉運密切相關[6]。cAMP激活劑Forskolin干預組、NF-κB抑制劑PDTC干預組、小青龍湯聯合玉屏風散治療組均能使AQP5表達上調,而PKA抑制劑H89能下調AQP5表達,說明小青龍湯合玉屏風散作用機制可能與NF-κB信號通路和cAMP-PKA信號通路有關。

3.2 NF-κB p65與變應性鼻炎

在本實驗中,正常組NF-κB p65未能檢測到,可能與其表達量很少有關。當AR大鼠經過卵蛋白基礎致敏和局部鼻腔激發后,NF-κB被激活后大量表達,AQP5表達下調,NF-κB抑制劑PDTC干預AR大鼠抑制NF-κB通路后,致使AQP5表達上調,表明NF-κB是變應性鼻炎發病的中心環節。小青龍湯聯合玉屏風散組亦能減少NF-κB表達,而其又能使AQP5表達上調,其可能的作用機制是抑制NF-κB信號通路的激活使AQP5表達上調,因激活后的NF-κB信號通路與cAMP-PKA-p-CREB競爭性結合轉錄輔助因子CBP,從而下調AQP5的表達。

3.3 p-CREB(Ser133)與變應性鼻炎

cAMP激活劑Forskolin能上調p-CREB (Ser133)表達,PKA抑制劑H89能下調p-CREB (Ser133)表達,表明cAMP-PKA-CREB信號轉導通路是變應性鼻炎發病重要環節之一。在NF-κB被激活后,p-CREB表達下調;PDTC干預AR大鼠抑制NF-κB通路后,p-CREB(Ser133)表達上調,這可能與NF-κB p65和轉錄輔助因子CBP相互作用有關。NF-κB和CREB都易受到CBP的調控[7],NF-κB只有在細胞核內與CBP結合才具有基因轉錄活性,但是CBP除了與NF-κB結合誘導基因轉錄以外,還能和p-CREB結合[8]。NF-κB與p-CREB(Ser133)競爭性結合CBP誘導特定靶基因轉錄,而細胞核內CBP表達量是相對有限的,NF-κB與p-CREB (Ser133)競爭性結合相對有限的CBP必然會導致依賴cAMP-PKA-CREB的基因轉錄下調[9]。小青龍湯聯合玉屏風散能夠抑制NF-κB信號通路的激活,通過cAMP-PKA-CREB信號通路與CBP的結合,上調p-CREB表達,從而使AQP5表達增加。

綜上所述,小青龍湯聯合玉屏風散治療AR的作用機制是抑制NF-κB信號通路的激活和興奮cAMP-PKA信號通路使AQP5表達上調,從而使AR的癥狀緩解,為以飲論治AR奠定了現代生物學基礎。

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Exploring the effect of Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng powder on the expression of AQP5, NF-κB p65 and p-CREB in rats with allergic rhinitis

MA Yan,WANG Jin-chang,WANG Shu-peng. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China

WANG Shu-peng,E-mail:sywangshupeng@163.com

Objective To observe the effect of the Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng power on the expression of AQP5、NF-kappaB p65 and p-CREB in nasal mucosa of allergic rhinitis rats in NF-kappaB signaling pathway,and reveal the mechanism of the Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng power in treating AR and the rationality of treating AR by phlegm and retained fluid.Methods 48 healthy male Wistar rats were divided into 6 groups by randomized bocks design:normal group,AR model group, Forskolin(cAMP activator)group,H89(PKA inhibitor)group,PDTC(NF-kappa B inhibitor),and the Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng power group,8 rats in each group.The AR rat model was made by the method of whole body sensitization and local attack.The expression of AQP5,NF-kappaB p65 and p-CREB were observed after the treatment.The results were statistically analyzed.Results The expression of AQP5 and p-CREB in the model group was decreased,and the expression of AQP5 and p-CREB in the Forskolin group,PDTC group,the Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng power group was increased, while the PKA inhibitor H89 could decrease the expression of AQP5.The expression of NF-kappaB p65 in the model group was increased,and the expression of NF-kappaB p65 in the Forskolin group,PDTC

Allergic rhinitis; Xiaoqinglong decoction; Yupingfeng power; NF-κB signal pathway; cAMP-PKA signaling pathway

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.11.009

2016-01-08)

(本文編輯:韓虹娟)

遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2013374)

110847 沈陽,遼寧中醫藥大學基礎醫學院

馬巖(1985-),碩士,醫師。研究方向:經方治療免疫性疾病的研究。E-mail:894957892@qq.com

王樹鵬(1973-),博士,教授,碩士生導師。研究方向:經方治療免疫性疾病的研究。E-mail:sywangshupeng@163.com

group,the Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng power group was decreased,while the PKA inhibitor H89 could increase the expression of NF-kappaB p65. Conclusion Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng powder treatment of allergic rhinitis mechanism may be related to the inhibition of NF-kappa B signaling pathway and cAMP-PKA signaling pathway to increase the AQP5 expression,which has laid the foundation of modern biology for treating AR by phlegm and retained fluid.