復方菖蒲益智湯對腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性的影響

徐麗娟 許斐 臧春柳 趙層閃 劉學飛 楊麗靜 田軍彪

·濁毒研究專題·

復方菖蒲益智湯對腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性的影響

徐麗娟 許斐 臧春柳 趙層閃 劉學飛 楊麗靜 田軍彪

目的 觀察復方菖蒲益智湯對小鼠腦缺血再灌注損傷早期腦組織中Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性的影響。方法 實驗小鼠隨機分為假手術組、模型組、復方菖蒲益智湯高、低劑量組、尼莫地平對照組。采用夾閉雙側頸總動脈的方法制備腦缺血再灌注損傷模型小鼠,給藥14天后進行神經功能損傷評分,并采用HE染色,光鏡下觀察海馬區腦組織的病理形態學變化,測定腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性。結果 各用藥組小鼠海馬區錐體細胞損傷程度、神經功能缺損程度比模型組均有所減輕,以復方菖蒲益智湯高劑量組效果最為明顯,高劑量組小鼠的Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性高于模型組、低劑量組及尼莫地平組(P＜0.01)。結論 復方菖蒲益智湯能夠提高腦缺血再灌注小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性,對于小鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用。

腦缺血再灌注損傷; 復方菖蒲益智湯; Ca2+-ATP酶; Na+-K+-ATP酶

缺血性腦血管病是臨床致殘率極高的常見病、多發病,腦缺血可導致神經細胞損傷,而恢復血流灌注后,腦組織損傷反而進一步加重,甚至出現不可逆性腦損傷,通常稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI),而腦缺血再灌注損傷早期是搶救缺血半暗帶神經細胞的關鍵時期[1]。復方菖蒲益智湯是田軍彪教授治療缺血性腦血管病的經驗方,具有化濁解毒、活血通絡的功效,是在中醫“濁毒”和“瘀血”理論指導下,針對中風主要病機“痰濁閉阻清竅,瘀毒損傷腦絡”而精選的有效方劑[2]。本實驗旨在通過觀察復方菖蒲益智湯對小鼠腦缺血再灌注損傷早期腦組織中Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性的影響,結合小鼠海馬區錐體細胞形態學改變以及小鼠神經功能損傷程度來探討本方在CIRI保護中的作用機理,為臨床治療提供客觀理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及分組

SPF級健康昆明小鼠50只,均為雄性,體質量(25±3)g,河北醫科大學實驗動物中心提供,許可證號:1202160。按照隨機數字表法,將小鼠分為5組:假手術組、模型組、中藥高劑量組(簡稱高劑量組)、中藥低劑量組(簡稱低劑量組)、尼莫地平對照組(簡稱尼莫地平組),每組10只。

1.2 實驗藥品及儀器

對照藥物:尼莫地平,規格為20 mg/片,天津市中央藥業有限公司生產,國藥準字H10910040。以蒸餾水溶解,配制成濃度為0.78 mg/mL的混懸液。

復方菖蒲益智湯(采用河北省中醫院中藥房所供飲片):石菖蒲15 g、益智仁15 g、當歸9 g、丹參15 g、川芎9 g、地龍15 g、赤芍15 g、茯苓15 g、郁金15 g、黃連6 g、澤瀉6 g。上述飲片由制劑室水煎濃縮后4℃保存。

主要試劑及儀器:蘇木素-伊紅染液,Na+-K+-ATP酶含量測定試劑盒,Ca2+-ATP酶含量測定試劑盒,以上試劑均購自南京建成生物工程研究所。水合氯醛、酒精、生理鹽水、高速冷凍離心機(上海安亭),半自動生化分析儀(Humalyzer)等均由河北醫科大學動物實驗中心提供。

1.3 模型制備

小鼠飼養于室溫24℃～26℃的動物實驗室(河北醫科大學西校區),術前禁食12小時,自由飲水。在無菌實驗室內行手術造模,采用微型動脈夾間斷夾閉雙側頸總動脈法造成小鼠腦組織缺血再灌注損傷[3]。將小鼠用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的劑量進行腹腔注射麻醉,取頸前正中縱行切口,長約1～1.5 cm,暴露頸總動脈,鈍性剝離雙側的頸總動脈,以微型動脈夾阻斷雙側頸總動脈血流,10分鐘后松開動脈夾,恢復頸總動脈血液灌注10分鐘,反復進行三次,再灌注24小時。其中假手術組分離頸總動脈后不進行動脈夾夾閉,余步驟與其余四組相同。術后給予保溫、預防感染等措施,保證小鼠正常進食、飲水。

1.4 給藥方法

造模成功后第2天開始給藥,高劑量組按照17.55 g/(kg·d)的劑量灌服復方菖蒲益智湯中藥液,低劑量組按照8.78 g/(kg·d)的劑量灌服中藥液,尼莫地平組按照0.03 g/(kg·d)的劑量灌服尼莫地平液,假手術組、模型組按照20 mL/(kg·d)的劑量灌服生理鹽水,每天1次,連續用藥14天。

1.5 檢測方法

術后24小時小鼠完全清醒后,以“5分法”進行神經行為學評分[4]。無神經缺損癥狀為0分;輕度局灶性神經功能缺損(不能完全伸展一側前肢)為1分;中度局灶性神經功能缺損(爬行時向一側轉圈)為2分;重度局灶性神經功能缺損(行走時向一側傾倒)為3分;意識水平降低,不能自主行走為4分;死亡為5分。1～3分為有效模型。剔除死亡、無效模型,并遵循隨機原則補充動物。

各組小鼠分別于給藥14天后予10%水合氯醛以0.40 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉,斷頭處死,立即在冰盤上取出腦組織,甲醛固定、脫水包埋、切片染色(蘇木精-伊紅hematoxylin-eosin staining,HE),在400倍光鏡下觀察各組小鼠海馬CAI區細胞形態學變化。

取右側腦皮質組織與4℃的生理鹽水混合,制成1%勻漿,經高速離心機以3000 rpm離心處理后

取上清液進行Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性測定。

1.6 統計學處理

采用SPSS 18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差(±s)表示,統計方法采用Dunnett’T3檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠神經功能缺損評分

手術后24小時,與假手術組相比,其余四組小鼠的神經功能評分顯著增高(P＜0.05),但小鼠神經功能評分無明顯差異,造模成功。連續用藥14天后,模型組小鼠神經功能評分明顯高于各給藥組(P＜0.05);中藥低劑量組及尼莫地平組小鼠的神經功能評分均高于中藥高劑量組(P＜0.05);尼莫地平組與中藥低劑量組小鼠的神經功能評分無明顯差異。見表1。 __

表1 各組小鼠神經功能缺損評分(±s,n=10)___

表1 各組小鼠神經功能缺損評分(±s,n=10)___

注:與模型組比較,aP＜0.05;與中藥高劑量組比較,bP＜0.05。

_______組別________________________________________________術后24小時用藥14天假手術組--模型組2.61±0.222.41±0.22中藥高劑量組2.52±0.171.51±0.17a中藥低劑量組2.30±0.212.23±0.28ab____尼莫地平組______2.55±0.1_____________________ 7 2.46±0.21ab__________

2.2 各組小鼠腦組織海馬CAI區錐體細胞形態

光鏡下觀察HE染色切片可見:假手術組小鼠海馬錐體細胞形態正常,核仁清晰,細胞質豐富,細胞排列整齊致密,層次清晰,未見膠質細胞增生,見圖1A。模型組小鼠海馬形態正常的錐體細胞明顯減少,且錐體細胞的細胞核固縮深染,層次稀疏,排列紊亂,有明顯的細胞脫失,大量膠質細胞增生,神經纖維雜見,見圖1B。高劑量組海馬形態正常的錐體細胞數量占絕大部分,偶見細胞核固縮深染及細胞脫失,細胞的排列較為整齊,但層次較假手術組有所減少,見圖1C。低劑量組、尼莫地平組海馬正常形態的錐體細胞數量減少,較多細胞可見核固縮及深染,細胞層次疏松,間隙增大,可見少量細胞脫失,見圖1D、1E。

2.3 各組小鼠腦組織Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶含量

與假手術組相比,其余四組小鼠腦組織中Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量明顯降低(P＜0.05)。與模型組相比,各用藥組小鼠腦組織中Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量明顯升高(P＜0.05)。與低劑量組及尼莫地平組相比,高劑量組的Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量升高(P＜0.05)。見表2。

圖1 CIRI小鼠海馬區錐體細胞病理形態(HE×400)

表2 各組小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量(±s,n=10)

表2 各組小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量(±s,n=10)

注:與假手術組比較,aP＜0.05;與模型組比較:bP＜0.05;與中藥高劑量組比較:cP＜0.05;與尼莫地平組比較:dP＞0.05。

組別Na+-k+-AT酶(U/mgprot)____________ Ca2+-ATP酶(U/mgprot)________ 6.08±0.113.85±0.07模型組2.80±0.16a1.85±0.04a尼莫地平組3.95±0.06bc2.67±0.06bc中藥高劑量組5.06±0.06ab3.26±0.04ab中藥低劑量組_____3.97±0.05bcd_______________2.71±0.05假手術組bcd_________

4 討論

現代醫學認為臨床治療缺血性卒中時不僅要及時恢復大腦血液供應,還應盡量減輕CIRI。針對CIRI發生機制的研究涉及細胞能量代謝障礙、鈣超載、免疫炎癥反應、凋亡基因啟動、氧自由基大量釋放、興奮性氨基酸的神經毒性作用等多個方面,多因素綜合作用下造成瀑布式級聯反應,最終導致腦細胞水腫、壞死、凋亡[5]。因為腦組織對缺血、缺氧的極度敏感,在腦缺血早期即可出現腦細胞氧化磷

酸化功能降低,ATP合成障礙,導致Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的降低,從而引起細胞內Na+、Cl-潴留,而K+大量外流,同時出現細胞內Ca2+轉運失常,導致胞漿內大量Ca2+沉積于線粒體,激活了細胞內多種降解酶釋放,引發細胞水腫、溶解、死亡等一系列損害,發生細胞毒性腦水腫。國內外研究認為,腦缺血再灌注后諸多因素共同導致的細胞內及細胞器內Ca2+超載是腦組織細胞死亡的“共同通路”。

中醫雖然沒有關于CIRI的文字記載,但CIRI是中風病發病過程中出現的一個病理過程,應歸屬于“中風”范疇;傳統認為中風之病機多由痰濁、瘀血蒙蔽清竅、阻滯脈絡而產生神識不清、肢體不遂、舌強語蹇等癥狀。筆者在中醫“濁毒”理論指導下,結合“瘀血”學說,發現對中風病機的傳統認識中,僅強調了“痰濁”“瘀血”,對“毒邪”致病認識不足,治療中不夠重視。結合臨床實踐認為,中風多發于老年人,其臟腑虛衰,脾失健運則痰濁內生,阻滯氣機,氣滯則血瘀,《血證論》云“血在上則濁蔽而不明矣”,瘀濁之為病,蘊積日久而成毒,“濁”“瘀”“毒”互為因果,損傷臟腑經脈而百病叢生。對中風病而言,其主要病機為“痰濁閉阻清竅,瘀毒損傷腦絡”。結合現代病理研究,急性腦缺血中的“濁毒”是因缺血、缺氧、能量代謝障礙引起的一系列病理過程中產生的大量有害物質,既是病因也是病理產物。臨床上制定了化濁解毒、活血通絡的治療大法,篩選出了復方菖蒲益智湯,治療中風、認知障礙等療效肯定。方中以石菖蒲開竅豁痰、化濁醒神,丹參、當歸、赤芍活血化瘀,川芎為血中氣藥,配合郁金行氣活血,蟲類藥地龍可清熱息風、通行經絡,茯苓、澤瀉滲濕利水以化濁,黃連清熱燥濕以解毒,益智仁溫腎固精,補益腦髓。現代藥理研究表明,石菖蒲的有效成份可以影響CaMKⅡ信號通路,調控凋亡基因表達,減少神經細胞凋亡[6];當歸多糖可抑制Cleaved caspase-3及bax的表達,同時增強bcl-2表達,從而減少腦缺血再灌注損傷大鼠海馬神經細胞的凋亡[7];丹參酮ⅡA可提高局灶性腦缺血急性期大鼠細胞核p-CREB和細胞TORC1的蛋白表達水平,減少腦梗死體積,在大鼠腦缺血急性期應用有腦保護作用[8];此外復方菖蒲益智湯中采用的中藥川芎、赤芍、地龍等均有確切的改善腦組織代謝的作用,可見中醫傳統理論指導下組方與現代醫學經驗亦相契合。

本實驗觀察了Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶在腦缺血再灌注損傷早期的含量變化,實驗結果證明,復方菖蒲益智湯能夠提高腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性,且高劑量中藥組療效更佳,該組小鼠海馬區錐體細胞的受損程度、神經功能損傷亦較輕,其機理可能與復方菖蒲益智湯改善了腦組織能量代謝水平以及抑制細胞內鈣超載有關,這為復方菖蒲益智湯臨床應用提供了一定的客觀理論依據,但該方藥亦存在調節炎癥因子釋放、抑制炎癥反應等作用機制[9],仍有進一步研究的價值。

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Protective effect of Changpu Yizhi compound decoction on cerebral ischemia and reperfusion injury in mice

XU Li-juan,XU Fei,ZANG Chun-liu,et al.Traditional Chinese Medicine Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050011,China

TIAN Jun-biao,E-mail:jbt1965@sina.com

Objective To observe the effect of Changpu Yizhi compound decoction on the activity of Ca2+-ATPase and Na+-K+-ATPase in brain tissue of mice in the early stage of cerebral ischemia and reperfusion injury.Methods Mice were randomly divided into sham operation group,model group,high and low doses of Changpu Yizhi compound decoction group and nimodipine control group.Cerebral ischemia and reperfusion injury(CIRI)mice model was prepared through blocking both side carotid arteries.After continuous medication for 14 days,neurological injury score was evaluated,and pyramidal cell morphology of the hippocampal region was observed under light microscope after HE staining.The activity of the Ca2+-ATPase and Na+-K+-ATPase in the brain tissue was detected.Results Compared with the model group,the injury of hippocampal pyramidal cells of each medical group was alleviated and neurological function deficit was lowered,especially in the high dose group.The activity of the Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in the high dose group was higher than that of the other groups except the sham operation group(P＜0.01).Conclusion Changpu Yizhi compound decoction could enhance the activity of

Cerebral ischemia and reperfusion injury; Changpu Yizhi compound decoction; Ca2+-ATPase; Na+-K+-ATPase

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.11.001

2016-05-13)

(本文編輯:禹佳)

河北省自然科學基金面上項目(H2013206393);河北省科技支撐計劃(15277748D);河北省省級中醫藥類重大醫學科研課題(zyzd2013004);河北省中醫藥管理局科研計劃(2014039);河北省政府資助臨床醫學優秀人才培養和基礎課題(361025)

050011 石家莊,河北省中醫院脾胃病科(徐麗娟、劉學飛、楊麗靜、田軍彪、);河北省晉州市人民醫院脾胃病科(許斐);河北省唐縣中醫院脾胃病科(臧春柳);河北省衡水市中醫院脾胃病科(趙層閃)

徐麗娟(1978-),女,碩士,主治醫師。研究方向:神經及腦血管疾病診治。E-mail:xlj_alice@ 126.com

田軍彪(1964-),博士,教授。研究方向:腦血管疾病中醫藥防治研究。E-mail:jbt1965@sina.com

the Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in mice with cerebral ischemia and reperfusion injury,indicated its protective effect on the injury.