硫化氫對臭氧致小鼠氣道炎癥的影響*

周玉波， 扶招弟， 周麗芬， 陳慶梓， 楊春濤， 李建華

(廣州醫科大學生理教研室，廣東 廣州 511436)

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硫化氫對臭氧致小鼠氣道炎癥的影響*

周玉波▲， 扶招弟▲， 周麗芬， 陳慶梓， 楊春濤， 李建華△

(廣州醫科大學生理教研室，廣東 廣州 511436)

目的： 研究硫化氫(H2S)對臭氧(O3)暴露所致小鼠氣道炎癥的影響，并探究其機制。方法: 32只C57BL/6小鼠隨機分為正常對照(control)組、O3組、硫氫化鈉(NaHS)+O3組以及 NaHS組。第1、3、5 天將O3組和NaHS+O3組小鼠置于2.14 mg/m3O3環境中暴露3 h，同時control組和NaHS組置于新鮮空氣中暴露3 h。每次暴露前30 min，NaHS+O3組和NaHS組小鼠腹腔注射NaHS(14 μmol/kg)。末次暴露24 h后測定小鼠氣道反應性，收集支氣管肺泡灌洗液用于炎性細胞計數和總蛋白測定，收集肺組織標本行HE染色觀察形態改變。測定肺組織中IL-6、IL-8、丙二醛(MDA)和NF-κB p65蛋白水平。結果：與control組相比，O3組的氣道反應性、炎性細胞數、總蛋白濃度和炎癥評分，以及IL-6、IL-8、MDA和NF-κB p65蛋白水平明顯增高，NaHS+O3組則明顯低于O3組。結論：H2S顯著減輕了O3暴露所致氣道炎癥反應，可能與抑制脂質過氧化和降低NF-κB表達相關。

硫化氫； 臭氧； 氣道炎癥

臭氧(ozone，O3)是最常見的空氣污染物之一，主要由機動車廢氣在陽光照射下形成。早期研究發現正常人短期內吸入O3可以導致肺功能下降、氣道反應性增加以及出現氣道炎癥反應[1-2]。近年研究發現O3引起的肺損傷主要與氧化應激和氣道炎癥相關[3]。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種新型氣體信號分子，可以調控氧化與抗氧化平衡，抑制炎癥反應，參與慢性阻塞性肺疾病、哮喘、急性肺損傷等多種呼吸系統疾病的病理生理過程[4-6]。H2S對O3暴露致小鼠氣道炎癥的作用及作用機制迄今鮮有報道。本研究在O3暴露前，給予外源性H2S供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)預處理，觀察H2S預處理對O3暴露致小鼠氣道炎癥的干預效果，同時初步探討其相關分子機制。

材 料 和 方 法

1 動物

C57BL/6小鼠，SPF級，雌雄各半，8～10周，20～22 g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2013-0002。所有動物均飼養于廣州醫科大學SPF級動物房，環境溫度22～24 ℃，濕度40%～70%，12 h光照控制，可自由進食進水。

2 主要試劑

NaHS(Sigma)，用生理鹽水溶解成1 mmol/L濃度；戊巴比妥鈉(天津市百世化工有限公司)；總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)；快速瑞氏-姬姆薩復合染色液和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠IL-6和IL-8 ELISA 試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；抗NF-κB p65抗體和HRP標記羊抗兔IgG(CST);抗GAPDH抗體(Bioword)；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

3 主要方法

3.1 實驗分組及模型建立 32只C57BL/6小鼠隨機分為正常對照(control)組、O3組、O3+NaHS組和NaHS組，每組8只。O3組和O3+NaHS組小鼠于第1、3、5天在2.14 mg/m3臭氧環境中暴露3 h，control組和NaHS組于相同環境下新鮮空氣暴露，暴露時禁食禁水。O3+NaHS組和NaHS組于O3暴露前30 min腹腔注射NaHS(14 μmol/kg)[6]。

3.2 亞甲基藍法測定內源性H2S合成酶活性 末次O3暴露24 h后，肺組織按照25 mg：1 000 μL的比例加入生理鹽水，勻漿至肉眼下無明顯組織塊，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液,亞甲基藍法測定內源性H2S合成酶活性。

3.3 氣道反應性的測定 末次O3暴露24 h后，使用BUXCO無創小動物肺功能儀檢測各組小鼠的氣道反應性。依次霧化吸入不同濃度(3.12、6.25、12.5、25和50 g/L)的氯化乙酰甲膽堿(methacholine，MCh)，測定相應濃度下增強的呼氣間歇(enhanced pause，Penh)值。以吸入生理鹽水(normal saline，NS)時的Penh值為基值，用Penh/NS%(MCh 激發的 Penh 值/NS激發的Penh 值×100%)最大值和PC100(氣道反應性升高為NS值2倍時的MCh激發濃度)綜合評價氣道反應性。Penh/NS%最大值越大，氣道反應性則越高；PC100值越小，氣道敏感性則越高。

3.4 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中白細胞總數及分類計數 測定氣道反應性后，戊巴比妥鈉麻醉小鼠，仰臥位固定，氣管插管，解剖分離出左肺后結扎左主支氣管，每次以0.4 mL PBS灌洗右肺，反復灌洗回收3次(回收率大于80%)，收集的BALF于4 ℃、1 500 r/min離心10 min，細胞用1 mL PBS重懸，吹打均勻后取10 μL于血細胞計數板上進行白細胞總數計數，余下的BALF于4 ℃、1 500 r/min離心10 min，棄上清，取細胞沉淀涂片，用姬姆薩染色法在光學顯微鏡下進行細胞分類計數(每例隨機計數200個細胞)。得各類細胞百分比，將其乘以白細胞總數即為各類細胞數。

3.5 BCA法檢測BALF中總蛋白濃度 按上述方法收集BALF，按照試劑盒說明檢測BALF中總蛋白濃度。

3.6 肺組織切片HE染色及分析 肺組織用4%多聚甲醛溶液固定，常規方法制備病理切片， HE染色后觀察肺組織病理變化。按照參考文獻的方法對HE染色肺部切片進行炎癥反應程度評分[7]。評分標準為：0分=無炎癥反應；1分=輕度炎癥反應，在氣管或血管周圍及肺泡壁存在局灶性的炎性細胞浸潤；2分=中度炎癥反應，在氣管或血管周圍及肺泡壁存在成片或局部的炎性細胞浸潤，累及的范圍小于1/3的肺橫截面積；3分=重度炎癥反應，在氣管或血管周圍及肺間質存在彌漫性的炎性細胞浸潤，1/3至2/3的面積受累。每只小鼠計數10個視野，取平均數作為每只小鼠的氣道炎癥反應評分。

3.7 ELISA法測定肺組織勻漿液中IL-6和IL-8的含量 制備肺組織勻漿液，10 mg肺組織加入1 mL生理鹽水充分勻漿，12 000 r/min離心10 min，收集上清液做ELISA，保存至-80 ℃。取肺組織勻漿液和試劑盒放至室溫平衡20 min。按照試劑盒說明檢測IL-6和IL-8的含量。

3.8 TBA法測定肺組織勻漿液中MDA的含量 肺組織按照10 mg∶100 μL的比例加入生理鹽水，勻漿至肉眼下無明顯組織塊。12 000 r/min離心10 min后取上清，按試劑盒說明操作檢測MDA蛋白濃度，MDA 含量結果以μmol/g表示。

3.9 Western blot法檢測NF-κB p65蛋白的表達情況 取25 mg肺組織放入5 mL的離心管中，加入200 μL 2%組織裂解液。在冰上將肺組織勻漿磨碎后充分裂解，4 ℃、14 000×g離心5 min，取上清液，按BCA試劑盒所示的方法測定蛋白質的濃度。各組取60 μg蛋白樣品于10% SDS-PAGE分離，電濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜上。將PVDF膜取出放入TBST溶液洗10 min 3次，5%脫脂奶粉封閉 1 h。封閉后用TBST緩沖液洗10 min 3次，加3% BSA稀釋的NF-κB p65(1∶1 000)及GAPDH(1∶2 000)4 ℃搖床孵育過夜。次日于室溫復溫1 h，用TBST緩沖液洗10 min 3次，加HRP標記羊抗兔IgG(1∶5 000)水平搖床室溫孵育1 h。用TBST緩沖液洗10 min 3次。經ECL化學發光劑曝光5 min，用ImageJ 軟件分析條帶吸光度值，用目標蛋白條帶與GAPDH條帶的吸光度值比值表示該蛋白的相對表達水平。

4 統計學處理

實驗數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 21.0統計軟件進行統計學分析。兩組間比較采用獨立樣本資料t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，在確定方差齊性后進行Bonferroni法檢驗，以P<0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 內源性H2S合成酶活性變化

O3組內源性H2S合成酶活性明顯低于control組(P<0．05)，見圖1。

Figure 1.The change of H2S synthase activity after O3exposure. Mean±SD.n=8.*P<0．05vscontrol group.

圖1 Control組與O3組H2S合成酶活性比較

2 氣道反應性變化

O3組的Penh/NS%最大值顯著高于control組和O3+NaHS組(P<0.01)，O3+NaHS組、NaHS組和Control組兩兩比較差異無統計學顯著性(P>0.05)。O3組PC100顯著低于control組和O3+NaHS組(P<0.01)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無統計學顯著性，見圖2。上述結果顯示，O3組的氣道反應性顯著高于control組，O3+NaHS組的氣道反應性顯著低于O3組。

Figure 2. Comparison of airway responsiveness in the mice with different treatments. Mean±SD.n=8.**P<0．01vscontrol group;##P<0．01vsO3group.

圖2 各組氣道反應性比值的變化

3 BALF中白細胞總數計數與分類計數情況

與control組和O3+NaHS組相比較，O3組BALF中白細胞總數、巨噬細胞數、中性粒細胞數和淋巴細胞數明顯增多(P<0．01)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無統計學顯著性，各組小鼠嗜酸性粒細胞數均無明顯變化，見表1。

4 BALF中總蛋白濃度變化

O3組BALF中總蛋白濃度明顯高于control組(P<0．05)，O3+NaHS組與O3組相比明顯降低(P<0．05)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無統計學顯著性(P>0．05)，見圖3。

表1 BALF的白細胞計數

*P<0．05vscontrol group;#P<0．05vsO3group.

Figure 3.Comparison of the protein concentrations in the BALF of different groups. Mean±SD.n=8.**P<0．01vscontrol group;##P<0．01vsO3group.

圖3 各組BALF總蛋白濃度比值的變化

5 肺組織病理形態學分析

光鏡下可見control組肺泡結構完整，支氣管管腔規則，黏膜上皮細胞排列有序，氣道周圍未發現炎性細胞浸潤現象。O3組可見肺泡壁結構受損，肺間質充血，支氣管管腔狹窄，氣管和血管周圍有明顯的炎性細胞浸潤現象。O3+NaHS組肺泡結構正常、氣管和血管周圍炎癥明顯減輕。NaHS組肺泡結構正常、氣管和血管周圍未見明顯異常，見圖4。

Figure 4.The morphological changes of the lung tissues in diffe-rent groups (HE staining, ×200).

圖4 各組肺組織的形態學改變

O3組炎癥反應評分明顯高于control組(P<0.01)，O3+NaHS組炎癥評分與O3組相比明顯降低(P<0.01)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較無顯著差異，見圖5。

Figure 5.Semiquantitative analysis of the lung inflammation in different groups by inflammatory scoring. Mean±SD.n=8.**P<0．01vscontrol group；##P<0．01vsO3group.

圖5 各組肺組織炎癥評分

6 肺組織勻漿液中IL-6和IL-8含量變化

O3組肺組織勻漿液中IL-6和IL-8含量明顯高于control組(P<0．01)，O3+NaHS組IL-6和IL-8含量與O3組相比明顯降低(P<0．01)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無統計學顯著性，見圖6。

7 肺組織勻漿液中MDA含量的變化

O3組肺組織勻漿液中MDA含量明顯高于control組(P<0．01)，O3+NaHS組MDA含量較O3組明顯降低(P<0．01)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無統計學顯著性，見圖7。

8 NF-κB p65蛋白在肺組織中的表達情況

O3組NF-κB p65蛋白相對表達量明顯高于control組(P<0．05)，O3+NaHS組NF-κB p65蛋白相對表達量較O3組明顯降低(P<0．05)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無統計學顯著性，見圖8。

討 論

O3作為一種強氧化性氣體，可與任何一種生物組織發生反應，其中對呼吸道的破壞最為嚴重。本研究中O3組小鼠氣道反應性增高，肺切片炎癥評分明顯增高，與我們以往發表的結果相似[8]。另外，實驗結果顯示O3暴露會導致BALF中白細胞總數明顯增多，巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和總蛋白濃度不同比例增多，肺組織勻漿液中脂質過氧化物MDA含量明顯增高。一方面，O3直接攻擊氣道上皮細胞，使其合成和分泌大量趨化因子和炎癥介質，引起炎癥細胞的浸潤，造成氣道損傷[9]。另一方面，O3與氣道上皮細胞膜上的不飽和脂肪酸和肺泡表面活性物質中的磷脂發生反應，產生臭氧化物自由基，引起氧化應激[10]。氧化應激導致機體活性氧和活性氮增多，它們可以直接刺激氣道感覺神經引起氣道反應性升高[11]。

Figure 6.The contents of IL-6 and IL-8 in the lung tissues of the mice. Mean±SD.n=8.**P<0．01vscontrol group;##P<0．01vsO3group.

圖6 各組肺組織IL-6和IL-8的含量

Figure 7.The MDA level in the lung tissues of the mice with different treatments. Mean±SD.n=8.**P<0．01vscontrol group;##P<0．01vsO3group.

圖7 各組肺組織MDA的含量

Figure 8.Determination of NF-κB p65 in the lung tissues by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0．05vscontrol group;#P<0．05vsO3group.

圖8 各組肺組織中NF-κB p65蛋白的表達

氧化應激能夠促進NF-κB p65入核，通過上調下游的環氧酶和誘導型一氧化氮合酶，產生新的過氧化物，進一步促進NF-κB的活化[12]。NF-κB既是氧化應激敏感性轉錄因子，也是炎癥放大過程中重要的調控節點。NF-κB可以促進炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子的表達，這些炎癥因子反過來又可以調控NF-κB的轉錄。我們的實驗結果顯示O3暴露會引起小鼠氣道炎癥的同時，肺部NF-κB p65的表達水平也明顯增高，組織勻漿液中炎癥因子IL-6和IL-8含量明顯增高。

H2S在清蛋白誘導的哮喘中發揮抑制氣道炎癥、氣道高反應和抗氣道重塑的作用[6]。內源性H2S主要由胱硫醚β-合成酶和胱硫醚γ-裂解酶催化產生，我們發現O3組小鼠肺部的H2S合成酶的活性明顯降低。給予外源性H2S使O3暴露后小鼠的氣道高反應性顯著減輕，逆轉了O3暴露導致的BALF中白細胞總數、巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和總蛋白濃度的增加，提示H2S可以減輕O3致小鼠氣道炎癥。H2S對氣道的保護機制十分復雜，首先，H2S具有廣泛而強大的抗氧化效應，不僅可以直接清除過氧化氫、超氧陰離子、過氧化亞硝酸等氧自由基，而且可以上調內源性的抗氧化系統，進而增強內源性抗氧化能力，減輕脂質過氧化反應[13-14]。其次，H2S本身也具有抗炎作用，H2S可以調控NF-κB核轉位，抑制促炎因子的表達，減輕呼吸道合胞病毒感染后的肺部炎癥反應[15]。我們發現H2S預處理明顯降低了O3暴露后肺組織MDA含量以及NF-κB p65的表達水平，提示H2S可能是通過減輕脂質過氧化反應和下調NF-κB p65的表達，在O3致氣道炎癥中發揮保護作用。

綜上所述，H2S在O3暴露引起的小鼠氣道炎癥中起到保護作用，有抗炎、抗氧化和降低氣道反應性的作用，為哮喘、慢性阻塞性肺疾病等疾病治療提供了新思路，其具體作用機制有待進一步探討。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of hydrogen sulfide on airway inflammation induced by ozone in mice

ZHOU Yu-bo, FU Zhao-di, ZHOU Li-fen, CHEN Qing-zi, YANG Chun-tao, LI Jian-hua

(DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China.E-mail:lijianh@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of hydrogen sulfide (H2S) on airway inflammation induced by ozone (O3) exposure and its mechanisms. METHODS: C57BL/6 mice (n=32) were randomly divided into control group, O3group, NaHS+O3group and NaHS group. The mice in O3group and O3+NaHS group were exposed to 2.14 mg/m3O3for 3 h on days 1, 3 and 5, while the mice in control group and NaHS group were exposed to filtered air. NaHS (14 μmol/kg) was administered intraperitoneally to the mice in NaHS group and O3+NaHS group 30 min before each exposure. After the last exposure for 24 h, the airway responsiveness was determined, and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected for counting inflammatory cells and measuring total protein concentration. The lung tissues were collected for observing the morphological changes with HE staining. The levels of interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), malondialdehyde (MDA) and NF-κB p65 protein in the lungs were determined. RESULTS: Compared with control group, the airway responsiveness, inflammatory cells, protein concentration, inflammation score, levels of IL-6, IL-8, MDA and NF-κB p65 in O3group increased significantly, but these in NaHS+O3group decreased compared with O3group.CONCLUSION: The present findings suggest that H2S attenuates O3induced airway inflammation by inhibiting NF-κB expression and preventing lipid peroxidation.

Hydrogen sulfide; Ozone; Airway inflammation

1000- 4718(2016)10- 1837- 06

2016- 03- 11

2016- 07- 11

國家自然科學基金資助項目(No. 81470205)

△通訊作者 Tel: 020-37103061; E-mail: lijianh@hotmail.com

▲并列第1作者

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.016

雜志網址： http://www.cjpp.net