FRAS1蛋白與非小細胞肺癌腦轉移的關系*

秦 嶺， 葛蒙晰， 周鑫莉， 黃若凡， 詹 瓊， 季笑宇, 2， 趙月華, 2， 梁曉華△

(1復旦大學附屬華山醫院腫瘤科，上海 200040； 2復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032； 3蕪湖市第二人民醫院，安徽 蕪湖 241000)

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·短篇論著·

FRAS1蛋白與非小細胞肺癌腦轉移的關系*

秦 嶺1, 3， 葛蒙晰1， 周鑫莉1， 黃若凡1， 詹 瓊1， 季笑宇1, 2， 趙月華1, 2， 梁曉華1△

(1復旦大學附屬華山醫院腫瘤科，上海 200040；2復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032；3蕪湖市第二人民醫院，安徽 蕪湖 241000)

目的： 探討FRAS1蛋白與非小細胞肺癌(NSCLC)腦轉移的關系。方法: 采用qPCR檢測FRAS1的mRNA在NSCLC腦轉移組織和同期原發灶組織中的表達水平，采用SP免疫組化法檢測FRAS1蛋白在肺癌組織和癌旁非腫瘤組織的表達水平，以及有腦轉移和無腦轉移NSCLC原發灶組織中FRAS1蛋白的表達水平。結果: FRAS1 mRNA 在肺癌腦轉移灶中的表達量是肺癌原發灶中的近10倍，差異具有統計學顯著性(P<0.05)；FRAS1蛋白在肺癌組織內表達，但在癌旁非腫瘤組織內未見表達；FRAS1 蛋白在有腦轉移NSCLC患者的肺癌組織中表達明顯高于無腦轉移NSCLC患者的肺癌組織，差異具有統計學顯著性(P<0.01)。結論: NSCLC組織中FRAS1蛋白表達可能與肺癌發生有關，同時肺癌組織中FRAS1蛋白高表達可能與肺癌腦轉移密切相關。

非小細胞肺癌； 腦轉移； 細胞外基質； FRAS1

肺癌的發病率在男性和女性中均居于第1位，死亡率位居第2位[1]。肺癌死亡率高的主要原因是患者確診時多已處于腫瘤晚期，其中相當一部分出現腦轉移[2]，并且常常缺乏有效的治療方法。許多腫瘤都可能出現腦轉移，然而將近2/3的成人腦轉移瘤患者系由肺癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤轉移所致[3]。目前普遍認為腫瘤轉移可能涉及多個步驟，包括腫瘤細胞從原發灶脫落, 黏附于細胞外基質(extracellular matrix， ECM)，逐步降解而后穿透ECM進入循環系統，逃避宿主免疫系統，進入靶器官定植，形成新生血管并不斷增殖形成轉移灶。 Fraser syndrome 1 (FRAS1)蛋白是一種ECM蛋白，在表皮基底膜的黏附和器官發育過程中起著重要的調控作用，與 FREM1和FREM2同屬一個家族[4]。FRAS1蛋白由FRAS1基因編碼，基因定位于染色體4q21，它的突變可引起Fraser綜合征，主要表現在呼吸、循環、生殖、神經系統等發育缺陷[5]。Xu等[6]研究發現子宮內膜癌患者血清中存在FRAS1蛋白，而健康人的血清中不存在。我們前期研究發現，FRAS1蛋白調控黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)信號，影響A459細胞的侵襲與轉移。因此，FRAS1蛋白與肺癌腦轉移可能有一定關系[7]。本研究我們檢測肺癌和癌旁組織中FRAS1蛋白的表達水平，觀察非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)腦轉移灶組織和同期肺癌原發灶組織中FRAS1 mRNA表達，以及有腦轉移和無腦轉移NSCLC肺癌組織中FRAS1蛋白表達水平的差異，探討FRAS1蛋白與NSCLC腦轉移的關系。

材 料 和 方 法

1 研究對象

收集自2008年1月1日～2013年10月31日在復旦大學附屬華山醫院因NSCLC手術切除的肺癌原發灶和/或腦轉移灶標本。用于分析FRAS1的mRNA的肺癌新鮮腫瘤組織標本3例(男2例，女1例，年齡42～69歲，中位年齡59歲)，肺癌腦轉移灶新鮮腫瘤組織標本11例(男7例，女4例，年齡40～69歲，中位年齡58歲)。用于分析NSCLC原發灶及其癌旁組織(取自所切除肺葉距離病灶>5 cm的組織)FRAS1蛋白表達的新鮮組織標本12例(男5例，女7例，年齡40～68歲，中位年齡58歲)。用于分析有無腦轉移的肺癌組織FRAS1蛋白表達的組織標本按1∶2分配，初診時頭顱增強磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)未見顱內占位但原發灶確診NSCLC后3年內頭顱增強MRI發現顱內占位者歸入腦轉移組(男19例，女11例，48～71歲，中位年齡58.5歲)；原發灶確診NSCLC 3年后頭顱增強MRI仍未發現顱內占位者歸入無腦轉移組(男38例，女22例，41～70歲，中位年齡58歲)。以上標本均經病理確診為NSCLC或者NSCLC腦轉移，同時排除其它惡性腫瘤病史，術前均未接受任何放化療及靶向治療。腫瘤組織病理類型均為非小細胞肺癌，其中肺腺癌65例，肺鱗癌28例，肺腺鱗癌6例，肺其它類型(大細胞癌、未分化癌等)6例，腦轉移性腺癌8例，腦轉移性鱗癌3例，平均隨訪時間 4.2 年。上述的新鮮組織標本為術后1 h內獲得，獲得后立即放液氮中保存；同時石蠟標本均在經過4%的甲醛溶液固定后，常規石蠟包埋，所有標本都經過兩位高年資病理醫師分別單獨讀片及復核。

2 主要試劑及儀器

組織RNA提取試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)；FRAS1和GAPDH引物(上海生工生物工程有限公司；序列詳見表1)；兔抗人 FRAS1 多克隆抗體(Abcam)；II 抗(福州邁新生物技術開發公司)；SYBR Green 熒光定量PCR試劑盒(Life Technologies)。PCR儀(Bio-Rad)；7500 Real-Time PCR儀(ABI)。

表1 qPCR擴增的引物序列

3 方法

3.1 實時熒光定量PCR (qPCR)檢測 分別取肺癌組織和腦轉移瘤組織，按RNA提取試劑盒說明書進行提取總RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA樣品的A260/A280以確定RNA純度，并計算出RNA濃度，并于-80 ℃冰箱保存備用；參照RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄反應。qPCR反應用GAPDH作為內參照，按照說明書加入SYBR 熒光染料、引物序列和模板cDNA在熒光定量PCR儀中進行反應。qPCR反應體系為ddH2O 6 μL、樣本模板cDNA 3 μL、熒光染料10 μL、上下引物各0.5 μL，配成20 μL 的體系。反應參數為 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、54℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共32個循環；72 ℃ 8 min。每個樣品3管重復。

3.2 免疫組織化學觀察與結果判斷 切片脫蠟置于濕盒中；用3%的過氧化氫去除過氧化物酶，靜置10 min，后用蒸餾水沖洗，置于pH 7.2堿性緩沖液中；微波高溫抗原修復10 min；隨后加入目的基因 I 抗4 ℃孵育過夜，再加入 II抗，再進行DAB顯色；后用蘇木素復染；再脫水、透明，最后用中性樹脂封片后顯微鏡下觀察拍照。每張切片選擇具有代表性的5個高倍視野(×400)進行觀察，每個視野計數100個腫瘤細胞，并采用雙盲法對染色結果進行評估。腫瘤細胞染色陽性比例≤5%為0分，陽性率5%～30%為1分，陽性率 30%～70%為 2 分，陽性率>70%為 3 分。染色強度：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。腫瘤細胞染色陽性比例計分和染色強度計分之和作為評判免疫組化染色陽性結果的標準；0～1 分為陰性(-)，2～3 分為弱陽性(+)，4～5 分為中度陽性(++)，6 分為強陽性(+++)。

3 統計學處理

使用SPSS 20.0統計分析軟件進行統計學分析。FRAS1 mRNA表達的比較采用t檢驗，FRAS1蛋白表達量的比較采用秩和檢驗。以P<0.05 表示差異有統計學意義。

結 果

1 FRAS1蛋白在NSCLC腫瘤組織和癌旁組織中的不同表達

免疫組織化學方法檢測結果發現，FRAS1蛋白在NSCLC腫瘤組織內表達呈陽性，癌旁非腫瘤組織內表達呈陰性，見圖1。

Figure 1.FRAS1 protein expression in the lung cancer tissue and tissue adjacent to carcinoma (×200). A: cytoplasmic protein expression in the tumor cells was positive, the arrow for lung cancer cells; B: FRAS1 protein expression was negative in the normal tissue adjacent to carcinoma.

圖1 FRAS1 蛋白在肺癌組織及癌旁組織中的表達

2 FRAS1 mRNA在NSCLC腦轉移瘤和原發灶組織中的表達

qPCR檢測結果發現, FRAS1 mRNA在NSCLC腦轉移樣本中的表達量約是肺癌樣本的10倍，兩組間差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of FRAS1 in the brain metastatic tumor tissues and the primary tumor zone of NSCLC. LA: the primary focal lung cancer samples (n=3); LTB: the lung cancer samples collected in brain metastatic zone (n=11). Mean±SD.*P<0.05vsLA group.

圖2 FRAS1 mRNA在肺癌腦轉移灶和原發灶組織中的表達情況

3 FRAS1蛋白在有腦轉移和無腦轉移的NSCLC腫瘤組織中的表達

免疫組織化學方法檢測結果表明，FRAS1蛋白在有腦轉移的NSCLC腫瘤組織組中表達明顯高于無腦轉移組，兩組間差異有統計學顯著性(P<0.01)，見圖3、表2。

Figure 3.The protein expression of FRAS1 in the NSCLC tissues (×200). A:-; B:+; C:++; D:+++. FRAS1 protein was mainly expressed in the cytoplasm of the tumor cells.

圖3 FRAS1蛋白在NSCLC患者肺癌組織中的表達

表2 FRAS1蛋白在有腦轉移和無腦轉移的NSCLC組織中的表達

Table 2.The protein expression of FRAS1 in the NSCLC tumor tissues with or without brain metastases

FRAS1proteinexpressionWithbrainmetastasesWithoutbrainmetastasesnConstituentratio(%)nConstituentratio(%)-13．6916．1+27．11017．9++828．62544．6+++1760．71221．4

討 論

顱內轉移瘤是成人最常見的顱內腫瘤，其發生率是顱內原發腫瘤的4～5倍[8]。腦轉移瘤的3大原發惡性腫瘤依次為肺癌(40%～50%)[9]、乳腺癌(20%～30%)[10]、惡性黑色素瘤(10%～40%)[11]。非小細胞肺癌約占肺癌的80%，首次就診時腦轉移的發生率約10%，在整個病程過程中腦轉移的發生率為40%～50%[12]。腦轉移也是肺癌治療失敗的常見原因，且腦轉移患者的生活質量和預后極差，即使經過手術、放化療、分子靶向等治療，腦轉移患者生存時間仍不理想；因此尋找與肺癌腦轉移特異性相關的生物標記物，在預測和治療肺癌腦轉移中顯得尤為重要。ECM作為腫瘤細胞生長的微環境，在腫瘤的轉移過程中發揮著“雙刃劍”作用。一方面，ECM可作為天然屏障，控制腫瘤細胞轉移；另一方面，重塑的ECM為腫瘤細胞創造適合生長的環境，導致腫瘤細胞轉移[13]。各種腫瘤的體內外實驗[14]表明，腫瘤細胞在黏附分子或基質成分誘導下激活或增強蛋白酶的活性，如金屬蛋白酶、尿纖溶酶原激活物、組織蛋白酶、類肝素酶等。這些蛋白酶能夠降解并重構ECM，調節腫瘤細胞與ECM的黏附，促進腫瘤新生血管形成，從而促進腫瘤細胞轉移。FRAS1蛋白作為一種調控基底膜形成的ECM蛋白，目前其功能研究主要見于Fraser綜合征和胚胎發育，在腫瘤中的作用僅限于其存在于子宮內膜癌患者血清中。

本研究發現肺癌組織中FRAS1蛋白表達陽性，而癌旁非腫瘤組織未表達，因此我們推測FRAS1蛋白表達可能與肺癌的發生具有相關性；目前FRAS1蛋白在惡性腫瘤組織中表達的相關研究甚少；因此FRAS1蛋白與肺癌有何關聯有待進一步研究。同時我們檢測FRAS1 的mRNA在腦轉移組織中的表達明顯高于肺癌原發灶組織；通過比較原發灶與轉移灶中FRAS1的mRNA表達差異，我們推測FRAS1蛋白可能在肺癌發生腦轉移過程中起著積極作用；并且經擴大樣本在肺癌組織中驗證發現：有腦轉移的肺癌組織中FRAS1蛋白表達明顯高于無腦轉移組，差異具有統計學意義。因此，我們認為肺癌組織中FRAS1蛋白高表達很可能與肺癌腦轉移密切相關。我們課題組之前研究發現FRAS1蛋白通過調控FAK信號來調控A549細胞的侵襲及轉移[7]；同時可能參與NF-κB和STAT3信號調控。并且體外實驗[15]顯示NF-κB和 STAT3可引起FREM1表達，增強腫瘤細胞的侵襲能力。這些可能只是FRAS1蛋白促進肺癌腦轉移的部分機制。

其它很多因素可能也參與了肺癌腦轉移的發生，例如神經-免疫調節因子在腦轉移過程中發揮重要作用；炎癥趨化因子可能定向引導腦轉移發生以及MMPs通過細胞外基質與血管生成相互作用在腦轉移過程中起到一定作用等。肺癌腦轉移的分子機制可能非常復雜，還需要我們開展更多深入的研究。

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2013[J]. CA Cancer J Clin, 2013, 63(1):11-30.

[2] Barnholtz-Sloan JS, Sloan AE, Davis FG, et al. Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System[J]. J Clin Oncol, 2004, 22(14):2865-2872.

[3] Taillibert S, Le Rhun E. Epidemiology of brain metastases[J]. Cancer Radiother, 2015,19(1):3-9.

[4] Pavlakis E, Chiotaki R, Chalepakis G. The role of Fras1/Frem proteins in the structure and function of basement membrane[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2011, 43(4):487-495.

[5] Alazami AM, Shaheen R, Alzahrani F, et al. FREM1 mutations cause bifid nose, renal agenesis, and anorectal malformations syndrome[J]. Am J Hum Genet, 2009, 85(3):414-418.

[6] Xu J, Min W, Liu X, et al. Identification of FRAS1 as a human endometrial carcinoma-derived protein in serum of xenograft model[J]. Gynecol Oncol, 2012, 127(2):406-411.

[7] Zhan Q, Huang RF, Liang XH, et al. Fras1 knockdown reduces A549 cells migration and invasion through downregulation of FAK signaling[J]. Int J Clin Exp Med, 2014, 7(7):1692-1697.

[8] Hatiboglu AM, Wildrick DM, Sawaya R. The role of surgical resection in patients with brain metastases[J]. Ecancermedicalscience, 2013, 7:308.

[9] Hubbs JL, Boyd JA, Hollis D, et al. Factors associated with the development of brain metastases: analysis of 975 patients with early stage non-small cell lung cancer[J]. Cancer, 2010, 116(21):5038-5046.

[10]Kim HJ, Im SA, Keam B, et al. Clinical outcome of central nervous system metastases from breast cancer: differences in survival depending on systemic treatment[J]. J Neurooncol, 2012, 106(2):303-313.

[11]Bafaloukos D, Gogas H. The treatment of brain metastases in melanoma patients[J]. Cancer Treat Rev, 2004, 30(6):515 -520 .

[12]Schuette W. Treatment of brain metastases from lung can-cer: chemotherapy[J]. Lung Cancer,2004, 45(2):S253-S257.

[13]Wu XZ, Chen D, Xie GR. Extracellular matrix remodeling in hepatocellular carcinoma: effects of soil on seed?[J]. Med Hypotheses, 2006, 66(6):1115-1120.

[14]van Dijk M, Goransson SA, Stromblad S. Cell to extracellular matrix interactions and their reciprocal nature in cancer[J]. Exp Cell Res, 2013, 319(11):1663-1670.

[15]Yoon S, Woo SU, Kang JH, et al. NF-κB and STAT3 cooperatively induce IL-6 in starved cancer cells[J]. Oncogene, 2012, 31(29):3467-3481.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Relationship between FRAS1 protein and brain metastases of NSCLC

QIN Ling1, 3, GE Meng-xi1, ZHOU Xin-li1, HUNAG Ruo-fan1, ZHAN Qiong1, JI Xiao-yu1, 2, ZHAO Yue-hua1, 2, LIANG Xiao-hua1

(1DepartmentofOncology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China;2DepartmentofOncology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032,China;3TheSecondPeople’sHospitalofWuhu,Wuhu241000,China.E-mail:xhliang66@sina.com)

AIM: To explore the relationship between FRAS1 protein and brain metastases of non-small cell lung cancer (NSCLC). METHODS: The mRNA expression of FRAS1 in the brain metastatic tumor tissues and primary tumor tissues of NSCLC was detected by qPCR. The protein expression of FRAS1 in the tumor tissues and normal tissues adjacent to tumor tissues of NSCLC was measured by SP method of immunohistochemistry. The protein expression of FRAS1 in NSCLC primary tumor tissues with or without brain metastases was also determined.RESULTS: The mRNA expression of FRAS1 in the brain metastatic zone was nearly 10 times higher than that in the primary tumor tissues, and there was significant difference between the 2 groups (P<0.05). FRAS1 protein was expressed in the NSCLC primary tumor tissues, but was not found in the normal tissues adjacent to primary tumor tissues. The protein expression of FRAS1 in the NSCLC with brain metastases was significantly higher than that without brain metastases (P<0.01). CONCLUSION: FRAS1 protein may be associated with the occurrence of NSCLC. The over-expression of FRAS1 protein may be related to brain metastases with NSCLC.

Non-small-cell lung cancer; Brain metastasis; Extracellular matrix; FRAS1

1000- 4718(2016)10- 1892- 04

2015- 12- 28

2016- 08- 22

國家自然科學基金資助項目(No. 81302010)；上海市科委自然科學基金資助項目(No. 13ZR1405000)

△通訊作者 Tel： 021-52888142； E-mail： xhliang66@sina.com

R734.2； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.025

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