miR-496過表達抑制結腸癌細胞生長和轉移

周靜怡， 鐘 冰， 劉 麗， 王 娟

(濟南市第五人民醫院消化科，山東 濟南 250022)

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miR-496過表達抑制結腸癌細胞生長和轉移

周靜怡△， 鐘 冰， 劉 麗， 王 娟

(濟南市第五人民醫院消化科，山東 濟南 250022)

目的： 研究miR-496過表達對結腸癌細胞生長和轉移的影響及其分子機制。方法: 運用生物信息學軟件篩選miR-496靶向相互作用蛋白；real-time PCR和Western blot法測定結腸癌細胞系HT29、HCT116、SW480以及正常結腸上皮細胞NCM460中miR-496、CTNNB1 mRNA和β-catenin蛋白的表達；運用Lipofectamine 2000將miR-496 mimics轉染HT29、HCT116和SW480細胞，分別命名為HT29-miR-496 mimics、HCT116-miR-496 mimics和SW480-miR-496 mimics細胞，轉染scramble為陰性對照；運用MTT法、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒法、克隆形成實驗和Transwell分別測定細胞活力、LDH漏出率、克隆形成能力和轉移能力；螢光素酶報告基因實驗測定miR-496啟動子活性；Western blot法測定β-catenin、真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白1(4E-BP1)、p-4E-BP1、低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)、p-LRP6、MMP-7、MMP-9、MMP-13以及TIMP-2的蛋白水平。結果: miR-496與β-catenin內源性相互作用；miR-496在HT29、HCT116和SW480細胞中低表達，而在NCM460高表達；β-catenin在HT29、HCT116和SW480細胞中高表達，而在NCM460低表達；培養24 h、48 h、72 h、96 h的HT29-miR-496 mimics、HCT116-miR-496 mimics和SW480-miR-496 mimics細胞活力、LDH漏出率、克隆形成率和轉移的細胞數均顯著低于對照組(P<0.05)；螢光素酶報告基因實驗結果顯示轉染miR-496 mimics細胞中的miR-496啟動子活性明顯增加(P<0.05)，分別是對照組的1.75倍、2.04倍和1.61倍。Western blot實驗結果顯示miR-496過表達抑制β-catenin蛋白表達，p-4E-BP1和p-LRP6的蛋白水平降低；siRNA或miR-496過表達介導的β-catenin表達下調能顯著抑制MMP-7和MMP-9的表達，促進TIMP-2的表達。結論: miR-496在結腸癌細胞中低表達，在正常結腸上皮細胞中高表達；miR-496過表達抑制結腸癌細胞的生長和轉移，其機制是通過抑制Wnt/β-catenin通路進一步抑制MMP-7和MMP-9表達，促進TIMP-2表達，從而抑制結腸癌細胞的惡性表型。

結腸癌； miR-496； Wnt/β-catenin； 細胞活力

結直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是一種嚴重威脅人類健康和生命最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率位居所有惡性腫瘤第3位和第5位[1]。資料顯示結腸癌發病率呈逐年增長趨勢，好發于40～60歲年齡階段人群[2]。早期結腸癌缺乏特異性表征，多數患者診斷時已達疾病晚期，且治療效果差，易復發和轉移。目前尚無特異的結腸癌分子靶向藥物，因此尋找和研發特異性治療結腸癌的靶向藥物已成為亟需解決的醫研問題。

微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)的發現給結腸癌患者帶來了希望，miRNAs是一類長度為18～25個核苷酸的單鏈非編碼微小RNA。越來越多的研究發現miRNAs的異常表達與大多數腫瘤的發生發展密切相關[3-4]，在癌細胞增殖、轉移、侵襲，細胞凋亡，周期調控和癌細胞耐藥性方面發揮重要作用[5-6]。miR-496位于人類14號染色體，其生物學功能尚不清楚，研究表明miR-496低表達與機體老化相關[7]，在骨細胞的形成和分化中具有重要作用[8]。研究發現miR-496過表達能抑制乳腺癌細胞的增殖，并具有MBD2依賴性[9]。最新研究發現miR-496在骨肉瘤細胞中低表達，而miR-496過表達通過調控β-catenin通路活性抑制骨肉瘤細胞的增殖和轉移[10]。目前國內外對miR-496的報道較少，其在腫瘤發生發展中的生物學功能尚不清楚，至今尚無miR-496在結腸癌細胞增殖和轉移中的報道。本研究通過生物信息學和細胞體外實驗探討miR-496在結腸癌細胞增殖和轉移中的作用及分子機制，為以miR-496為靶點研發治療結腸癌的分子靶向藥物提供科學依據。

材 料 和 方 法

1 細胞株與試劑

人結腸癌細胞系HT29、HCT116、SW480及正常結腸上皮細胞NCM460購自中國科學院上海細胞生物研究所；RPMI-1640培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素、鏈霉素和胰酶購自Gibco；MTT和二甲基亞砜購自Sigma；Transwell 板購自Corning；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；抗4E-BP1、p-4E-BP1、LRP6、p-LRP6和β-catenin抗體購自Cell Signaling Technology；抗MMP-7、MMP-9、MMP-13和TIMP-2抗體購自Abcam；過氧化物酶標記的 II 抗IgG和抗β-actin抗體購自Santa Cruz；mirVana miRNA分離試劑盒和Taqman miRNA試劑盒購自Applied Biosystems；反轉錄試劑盒(PrimeScript?RT reagent kit with gDNA Eraser)和real-time PCR 試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ)購于TaKaRa；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo。β-catenin的siRNA序列和陰性對照siRNA序列由上海生工合成；miR-496 mimics和scramble序列均由廣州博銳生物科技有限公司設計并合成。

2 方法

2.1 生物信息學分析 通過miRWalk在線軟件(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)進行預測和分析miR-496潛在的相互作用因子。將miR-496基因序列輸入miRanda軟件(http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do)進行熱力學穩定性評分和序列保守性評分檢測，以預測與miR-496最可能結合的靶蛋白。評判標準參照文獻[11]：mirSVR≤-0.1，分值越低說明結合越穩定；PhastCons≥0，分值越高越好，以熱力學穩定性分值為主要參數，PhastCons分值一般為 0.5～0.8較好。分析篩選獲得miR-496潛在的靶蛋白即β-catenin。

2.2 細胞培養 HT29、HCT116、SW480和NCM460細胞培養于RPMI-1640培養基(含10% FBS、1%青霉素、1%鏈霉素)中，置于37 ℃、5% CO2及95%濕度的培養箱中培養至細胞融合度達到90%左右時進行細胞傳代。

2.3 Real-time PCR 將生長良好的NCM460、HT29、HCT116和SW480細胞消化計數后，以細胞密度為每孔1.5×106個接種到90 mm皿中，培養至細胞融合度達到90%時收集細胞，按照mirVana miRNA分離試劑盒的步驟提取miRNA；按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，分光光度計測定其吸光度(A)值。按照RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，反應條件為：42 ℃ 1 h；70 ℃ 10 min；4 ℃10 min。最后cDNA于-80 ℃保存。取2 ng cDNA進行real-time PCR，用于擴增的sense引物為5’-GCAATCCTGAGGAAGAGGATGTGGA-3’，anti-sense引物為5’-TCTGAGCTGCGAGTCATT-3’。反應條件為:94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 10 min。運用Taqman miRNA檢測試劑盒測定miRNA-496的表達，采用SYBR GreenⅡ熒光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)進行real-time PCR數據分析，結果經內參照U6校正，miR-496的相對表達量用2-ΔΔCt表示，進行3次獨立重復實驗。

2.4 細胞轉染 將生長良好的HT29、HCT116和SW480細胞消化計數后，以細胞密度為每孔2.5×105個接種于6孔板中，培養至細胞融合度達到85%左右時按照Lipofectamine 2000說明書進行miR-496 mimics細胞轉染，以轉染scramble為對照，轉染的細胞命名為HT29-miR-496 mimics、HCT116-miR-496 mimics、SW480-miR-496 mimics、HT29-scramble、HCT116-scramble和SW480-scramble細胞。轉染4 h后換成完全培養基，未轉染的細胞為空白對照，細胞置于培養箱中培養用于后續實驗。

2.5 MTT實驗檢測細胞活力 轉染的細胞經消化計數后，以細胞密度為2×107/L接種于96孔板中，分別培養24 h、48 h、72 h、96 h時進行MTT實驗，同時設空白對照組。每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，37 ℃繼續培養4 h，棄掉培養液，每孔加入150 μL DMSO，搖床上室溫振蕩5 min，用酶標儀測定490 nm處的A值，按下式計算細胞生長抑制率：

細胞增殖抑制率(%)=

2.6 檢測細胞中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率 轉染的細胞經胰酶消化后，調整細胞密度為1×108/L接種于96孔板中， 同時設細胞自然釋放對照組(DMEM培養基)，最大釋放對照組(0.8% Triton X-100)，每組各設5個復孔。37 ℃、5% CO2溫箱中分別培養24 h、48 h、72 h、96 h，最大釋放孔在結束培養前加入終濃度為0.8% 的Triton X-100，作用45 min。分別從對應的培養板中取100 μL上清加入ELISA板中，37 ℃孵育10 min后，加入新鮮配制的100 μL LDH底物溶液，室溫避光反應15 min，每孔加入1 mol/L檸檬酸終止液30 μL，用酶標儀在490 nm 處讀取各孔A值, 并計算LDH漏出率:

2.7 克隆形成實驗 轉染的細胞經胰酶消化計數后，以每皿500個接種于90 mm皿中，設3個平行實驗，培養直到通過肉眼能清晰觀察到可見的細胞克隆(約15 d)；棄掉培養基，PBS洗滌，甲醇室溫固定10 min，PBS洗滌，吉姆薩室溫染色10 min，自來水清洗，晾干后計數，按下列公式計算細胞克隆形成率：

2.8 細胞遷移實驗 轉染的細胞經胰酶消化，在Transwell每個培養孔上室中加入1.5×104個細胞，下室為無血清培養基，設置空白對照組；37 ℃繼續培養6 h后經4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，結晶紫染色，洗滌。用棉簽輕輕擦去上室的貼壁細胞，在顯微鏡下觀察5個視野，拍照并計數從Transwell上室遷移至微孔膜下層的細胞，每組設3個復孔，計數重復3次，取平均值。通過每組Transwell的遷移細胞數比較細胞的遷移能力。

2.9 螢光素酶-報告基因檢測 轉染的細胞經胰酶消化，計數后以細胞密度為每孔1.5×105個接種于24孔板中，待細胞融合度為80%左右時進行細胞轉染。按照Lipofectamine 2000說明書將200 ng TOPflash報告質粒和10 ng FOPFlash海腎螢光素酶對照質粒共轉染細胞，48 h后收集細胞。加入1×被動裂解緩沖液重懸細胞，置于4 ℃裂解24 h，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清并測定細胞上清中螢光素酶的活性。以海腎螢光素酶活性為內參照計算樣品中螢火蟲螢光素酶的活性。

2.10 Western blot實驗 轉染的細胞培養48 h時用細胞刮將細胞從培養皿中刮下，離心收集細胞，用RIPA(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS)重懸，超聲破碎，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，按照BCA試劑盒說明書測定總蛋白濃度。每個樣本取30 μg進行SDS-PAGE，半干法將蛋白轉移到PVDF膜上，10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育 I 抗(抗β-catenin、4E-BP1、p-4E-BP1、LRP6、p-LRP6、MMP-7、MMP-9、MMP-13和TIMP-2抗體)，以β-actin為內參照，4 ℃過夜。TBST洗膜、孵育 II 抗，室溫孵育1 h。ECL顯影后掃描，蛋白相對表達量經內參照校正后經Quantity-One軟件分析。

3 統計學處理

每個實驗進行3次獨立重復試驗。應用SPSS 17.0統計軟件進行相關數據分析，結果用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間的比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-496和β-catenin在結腸癌細胞中的表達

Real-time PCR結果顯示，miR-496在正常結腸上皮細胞中高表達，而在結腸癌細胞系HT29、HCT116和SW480細胞中的表達顯著降低，與NCM460細胞比較差異有統計學顯著性(P<0.01)；相反，β-catenin的編碼基因CTNNB1的mRNA在NCM460細胞中低表達，在HT29、HCT116和SW480高表達，其表達量顯著高于NCM460細胞(P<0.01)；Western blot實驗結果進一步證實β-catenin蛋白在NCM460表達量明顯低于3種結腸癌細胞，見圖1。

2 上調miR-496表達對結腸癌細胞活力的影響

如圖2所示，通過脂質體將miR-496 mimics轉染結腸癌細胞48 h后，real-time PCR檢測miR-496的表達，結果表明miR-496在結腸癌細胞中過表達，顯著高于陰性對照(scramble)組(P<0.05)；MTT實驗結果顯示，與對照組比較，miR-496過表達顯著抑制HT29、HCT116和SW480細胞活力(P<0.05)。隨著轉染時間的增加，細胞活力逐漸下降，呈現時間依賴關系，見圖2。

3 上調miR-496表達對結腸癌細胞LDH漏出率的影響

如圖3所示，與對照組比較，miR-496過表達顯著抑制HT29、HCT116和SW480細胞的LDH漏出率(P<0.05)，隨著轉染時間的增加，細胞LDH漏出率逐漸下降，呈現時間依賴關系。

4 上調miR-496表達對結腸癌細胞克隆形成能力的影響

如圖4所示，轉染miR-496 mimics的結腸癌細胞克隆形成能力顯著降低，HT29、HCT116和SW480細胞的克隆形成率分別降低至64.4%、56.8%和23.5%，與對照組比較差異有統計學顯著性(P<0.01)。結果表明，上調miR-496表達能抑制結腸癌細胞的克隆形成。

5 上調miR-496表達對結腸癌細胞侵襲能力的影響

Transwell結果顯示，對照組細胞遷移的數量明顯增多，而miR-496 mimics轉染的結腸癌細胞轉移至下室的細胞顯著降低，與對照組比較差異具有統計學顯著性(P<0.05)，提示miR-496 mimics過表達能抑制結腸癌細胞的轉移和侵襲能力，見圖5。

Figure 1.The expression of miR-496 and β-catenin detected by TaqMan real-time PCR (A) and Western blot (B) in NCM460 cells and colon cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNCM460 cells.

圖1 miR-496和β-catenin在NCM460細胞和結腸癌細胞中的表達

Figure 2.The effect of miR-496 over-expression on the cell activity of colon cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscramble.

圖2 上調miR-496表達對結腸癌細胞活力的影響

Figure 3.The effect of miR-496 over-expression on the LDH leakage rate of colon cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscramble.

圖3 上調miR-496表達對結腸癌細胞LDH漏出率的影響

Figure 4.The effect of miR-496 over-expression on the colony formation abilities of the colon cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscramble.

圖4 上調miR-496表達對結腸癌細胞克隆形成能力的影響

Figure 5.The effect of miR-496 over-expression on the metastatic ability of the colon cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscramble.

圖5 上調miR-496表達對結腸癌細胞遷移能力的影響

6 上調miR-496表達對β-catenin信號通路的影響

運用TOPflash螢光素酶報告基因實驗檢測上調miR-496表達對Wnt/β-catenin信號通路的影響，結果表明miR-496 mimics轉染的HT29、HCT116和SW480細胞的TCF啟動子活性顯著增加(P<0.05)，分別增高1.75倍、2.04倍和1.61倍。Western blot實驗的結果顯示，miR-496過表達抑制β-catenin蛋白水平，p-LPR6和p-4E-BP1蛋白水平明顯降低，提示上調miR-496表達能抑制Wnt/β-catenin信號通路及影響其下游分子事件,見圖6。

7 miR-496調控β-catenin信號通路對MMP家族關鍵靶基因的影響

Figure 6.The effect of miR-496 over-expression on the protein levels of β-catenin pathway-related molecules in the colon cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscramble.

圖6 上調miR-496表達對β-catenin信號通路的影響

我們進一步研究miR-496通過調控β-catenin信號通路對細胞轉移相關基因表達調控的影響。Western blot實驗的結果發現，在SW480細胞中干擾β-catenin表達后，與轉移相關蛋白MMP-7和MMP-9的表達被抑制，而MMP-13蛋白表達無明顯變化，TIMP-2表達增高；進一步研究發現在3種結腸癌細胞中miR-496過表達顯著抑制β-catenin的表達，同時MMP-7和MMP-9的表達顯著降低，TIMP-2表達升高，而MMP-13蛋白的表達無明顯變化，結果提示上調miR-496表達通過抑制β-catenin信號通路進而抑制細胞轉移基因最終抑制結腸癌細胞侵襲和轉移，見圖7。

討 論

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，嚴重危害人類健康和生命，其發病率在歐美國家僅次于肺癌和胃癌。資料統計，我國結腸癌的發病率呈逐年上升趨勢，好發于40～50歲的年齡組人群[12]。目前結腸癌治療手段包括手術切除、放療/化療、免疫治療，但總體療效及預后不佳。結腸癌的發病原因復雜，涉及細胞増殖與周期異常、凋亡通路被抑制及Wnt/β-catenin等多條信號通路失調等[13]。因此，探索新型的高效低毒的靶向抗癌藥物對結腸癌的治療顯得非常重要。

MicroRNA廣泛存在于真核生物中，參與細胞的分化、增殖、侵襲和轉移、細胞凋亡、周期調控等過程[14]，其異常表達與腫瘤的發生發展密切相關[5-6]。早期研究發現miR-496與人類老年化相關[7]，其表達上調可促進骨細胞形成[8]。Alvarado等[9]發現miR-496與乳腺癌的發病有關，在乳腺癌發生發展中具有重要作用。最新研究發現miR-496在骨肉瘤細胞中低表達，其過表達通過調控β-catenin通路活性抑制骨肉瘤細胞的增殖和轉移[10]。本研究發現，miR-496在結腸癌細胞中低表達，而在正常結腸上皮細胞中高表達，與文獻報道[10]miR-496在轉移性高的骨肉瘤細胞和組織中低表達，而在瘤旁骨纖維化組織和惡性程度較低的骨肉瘤細胞中高表達相類似，提示miR-496是一種腫瘤抑制因子。進一步研究發現miR-496過表達顯著抑制結腸癌細胞系HT29、HCT116和SW480細胞的活力、克隆形成能力、細胞侵襲和轉移，提示miR-496在結腸癌發生發展具有重要作用。

腫瘤轉移的分子機制涉及到許多信號通路的改變，本研究對miR-496過表達抑制結腸癌細胞生長和轉移可能的分子機制進行深入研究，生物信息學分析發現miR-496與Wnt/β-catenin信號通路相互作用。Wnt/β-catenin信號通路在進化中極為保守，在腫瘤轉移信號通路中占有重要地位，Wnt配體能激活Wnt/β-catenin通路，Wnt與FZD受體結合誘導LRP6受體磷酸化。研究發現，大多數腫瘤如鼻咽癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌等中發生Wnt/β-catenin信號通路的異常[15]。越來越多的證據表明Wnt信號通路與腫瘤侵襲轉移密切相關，參與腫瘤細胞的細胞骨架形成、遷移、黏附及腫瘤的血管生成等，在腫瘤侵襲轉移過程中起著重要作用[16-17]。本研究發現miR-496過表達能抑制β-catenin表達，其受體家族成員LRP6磷酸化水平顯著降低，提示miR-496過表達抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，這可能是miR-496過表達抑制結腸癌細胞增殖的分子機制之一。

Figure 7.The effect of miR-496-regulated β-catenin pathway on the protein expression of the MMP family in the colon cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscramble.

圖7 miR-496調控β-catenin信號通路對MMP家族關鍵靶基因的影響

我們進一步研究發現，與細胞轉移相關的基質金屬蛋白酶MMP-7、MMP-9以及它們的抑制因子TIMP-2受到miR-496的調控，miR-496過表達抑制MMP-7和MMP-9的表達，相反則促進TIMP-2的表達；相同情況下miR-496對MMP-13的表達無影響，提示miR-496對MMP家族成員的表達調控具有特異性。我們的研究也發現單獨下調β-catenin表達能抑制MMP-7和MMP-9的表達和促進TIMP-2表達，提示miR-496通過調控β-catenin信號通路活性對MMP家族關鍵靶基因的調控影響結腸癌細胞的惡性表型，存在miR-496→Wnt/β-catenin→MMP-7/MMP-9/TIMP-2信號通路。然而，miR-496的生物學功能仍不完全清楚，本研究為以miR-496為靶點研發治療結腸癌的分子靶向藥物提供了科學依據。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

緊密連接蛋白1通過EGFR/JAK1/STAT3信號調節多發性

骨髓瘤中蛋白酶體容量和蛋白酶體抑制劑敏感性

蛋白酶體抑制劑的應用已經徹底改變了多發性骨髓瘤的預后，但它們的臨床應用都是經驗性用藥，而原發性和繼發性耐藥是目前所面臨的新問題。Zhang等曾報道緊密連接蛋白1(tight junction protein 1, TJP1)是作為漿細胞蛋白酶體抑制劑的易感性的一個決定因素。他們進一步研究表明，TJP1抑制具有催化活性免疫蛋白酶體亞基LMP(low molecular mass protein)7和LMP2的表達，降低蛋白酶的活性，以及在體外和體內增強蛋白酶抑制劑敏感性的作用。這一機制的發生過程，是由于TPJ1介導了表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)/Janus 激酶1(Janus kinase 1, JAK1)/信號轉導及激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)通路的信號抑制，從而調節LMP7和LMP2的表達水平。在臨床上，多發性骨髓瘤患者瘤細胞中高表達的TJP1可能與患者對硼替佐米的反應性以及更長的作用持續時間有很大關系，聯合使用TJP1作為生物標志物，采取個性化的治療方案，可以確保病人從蛋白酶抑制劑治療中獲得最大受益。

Cancer Cell, 2016, 29(5):639-652(范沖竹)

miR-496 over-expression inhibits growth and metastasis in colon cancer cells

ZHOU Jing-yi, ZHONG Bing, LIU Li, WANG Juan

(DepartmentofGastroenterology,TheFifthPeople’sHospitalofJinan,Jinan250022,China.E-mail:zhoujingyi@163.com)

AIM: To investigate the effect of miR-496 over-expression on the growth and metastasis of colon cancer cells and its molecular mechanism. METHODS: The proteins interacting with miR-496 were screened by bioinformatic method. The levels of miR-496, CTNNB1 mRNA and β-catenin protein in colon cancer cell lines, HT29, HCT116 and SW480, and normal colonic epithelial cell line NCM460 were detected by real-time PCR and Western blot. HT29, HCT116 and SW480 cells were transfected with miR-496 mimics using Lipofectamine 2000 and named as HT29-miR-496 mimics, HCT116-miR-496 mimics and SW480-miR-496 mimics cells, respectively, and the cells transfected with the scramble served as negative control. The cell viability, lactate dehydrogenase (LDH) leakage, and colony formation and metastatic abilities were determined by MTT assay, LDH assay, colony formation assay and Transwell method, respectively. The promoter activity of miR-496 was measured using luciferase reporter gene assay. The protein levels of β-catenin, eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 (4E-BP1), p-4E-BP1, low-density lipoprotein receptor-related protein 6(LRP6), p-LRP6, MMP-7, MMP-9, MMP-13 and TIMP-2 were monitored by Western blot. RESULTS: Endogenous miR-406 interacted with β-catenin was found in the colon cancer cells. Low miR-496 expression in the HT29, HCT116 and SW480 cells and high miR-496 expression in NCM460 cells were detected. In contrast, high β-catenin expression was found in the HT29, HCT116 and SW480 cells and low β-catenin expression was observed in the NCM460 cells. Compared with control group, the cell viability, colony formation rate and the number of metastatic cells remarkably decreased in the HT29-miR-496 mimics, HCT116-miR-496 mimics and SW480-miR-496 mimic cells (P<0.05). The promoter activity of miR-496 was significantly increased in colon cancer cells transfected with miR-496 mimics, and was 1.75, 2.04 and 1.61 times as high as control group. miR-496 over-expression inhibited β-catenin levels, and p-4E-BP1 and p-LRP6 protein levels were also reduced. siRNA- or over-expressed miR-496-mediated β-catenin down-regulation inhibited MMP-7 and MMP-9 expression, but promoted TIMP-2 expression. CONCLUSION: The expression level of miR-496 in the colon cancer cells is low, but in the normal colonic epithelial cells is high. miR-496 over-expression inhibits the protein levels of MMP-7 and MMP-9, and promotes the protein expression of TIMP-2 via inhibiting Wnt/β-catenin pathway, thus suppressing malignant phenotype in the colon cancer cells.

Colon cancer; miR-496; Wnt/β-catenin; Cell viability

1000- 4718(2016)10- 1815- 09

2016- 06- 27

2016- 08- 03

△通訊作者 Tel: 0531-87197176； E-mail: zhoujingyi@163.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.013

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