質子泵抑制劑泮托拉唑鈉抑制肺癌細胞上皮間質轉化和順鉑耐藥的機制研究*

宋 嘉， 王 劍， 李 玉， 胡慧珍， 嚴 杰， 吳麗君， 徐 煒， 陳清勇

(中國人民解放軍第一一七醫院，浙江 杭州 310013)

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質子泵抑制劑泮托拉唑鈉抑制肺癌細胞上皮間質轉化和順鉑耐藥的機制研究*

宋 嘉▲， 王 劍▲， 李 玉， 胡慧珍， 嚴 杰， 吳麗君， 徐 煒， 陳清勇△

(中國人民解放軍第一一七醫院，浙江 杭州 310013)

目的： 探索泮托拉唑鈉(pantoprazole sodium，PPZ)抑制肺癌細胞上皮間質轉化和順鉑耐藥的分子機制。方法: 通過MTT法、劃痕修復實驗、Transwell實驗和Western blot 法比較A549細胞與A549/DDP細胞之間的形態、侵襲能力、遷移能力、藥物敏感性和蛋白表達差異, 觀察泮托拉唑鈉對A549/DDP細胞的形態、侵襲能力、遷移能力、藥物敏感性和蛋白表達的影響。結果: 與A549細胞比較，A549/DDP細胞存在高侵襲能力、高遷移能力、對順鉑耐藥、具有間質表型和c-Met/AKT/mTOR通路活化等特點，泮托拉唑鈉可抑制A549/DDP細胞的侵襲和遷移能力，逆轉其耐藥及間質表型，抑制c-Met/AKT/mTOR通路的活化。應用c-Met抑制劑SU11274、PI3K抑制劑LY294002和mTOR抑制劑rapamycin處理A549/DDP細胞后的作用與泮托拉唑鈉相似。結論: 泮托拉唑鈉抑制c-Met/AKT/mTOR信號通路抑制肺癌細胞侵襲、遷移、上皮間質轉化和順鉑耐藥。

泮托拉唑鈉； 肺癌； 上皮間質轉化； 耐藥

肺癌已成為發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，而轉移和耐藥是晚期肺癌患者死亡的主要原因[1]。如何抑制肺癌轉移及耐藥是當前肺癌治療的核心問題之一。順鉑是臨床一線化療的常用藥物，而隨著疾病進展，臨床上肺癌患者最終不可避免地出現對順鉑耐藥，致使化療失敗，最終導致患者死亡。因此，發現新的藥物、提高肺癌對順鉑化療敏感性有望延長肺癌患者生存期，從而使肺癌患者獲益，具有十分重要的臨床意義。

以往的研究顯示，上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤轉移、耐藥密切相關[2-3]，而近期發表在《Nature》的2個研究顯示[4-5]，較腫瘤轉移而言，上皮間質轉化可能與腫瘤耐藥的關系更加密切，進一步凸顯了上皮間質轉化在腫瘤耐藥中的地位。由此可見，抑制腫瘤上皮間質轉化可能是逆轉腫瘤耐藥的重中之重。

質子泵抑制劑(proton pump inhibitors，PPIs)是臨床上用于治療泌酸相關疾病的藥物，常用于治療胃炎、胃潰瘍、食管炎等疾病，而近年來有越來越多的文獻報道將其用于治療腫瘤的研究。目前已有報道，PPIs可通過多種途徑抑制胃癌[6]、乳腺癌[7]、黑色素瘤[8]、肝癌[9]、胰腺癌[10]等多種腫瘤的增殖，誘導凋亡，逆轉其耐藥。而關于其在肺癌中的作用及其相關機制尚無文獻報道。本研究將探索泮托拉唑鈉(pantoprazole sodium，PPZ)能否逆轉肺癌上皮間質轉化和對順鉑耐藥及其可能存在的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞系 A549細胞和A549/DDP細胞購自中國典型培養物保藏中心。

1.2 主要試劑 泮托拉唑鈉購自杭州中美華東制藥有限公司；用生理鹽水配制成20 g/L濃度母液備用，-20 ℃保存；MTT、順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，DDP)購自Sigma；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自杭州化學試劑有限公司；Transwell小室購自Pierce；c-Met抑制劑SU11274、PI3K抑制劑LY294002和mTOR抑制劑rapamycin購自Selleck Chemicals；抗p-c-Met(Y1234/35)、c-Met、p-Akt(S473)、p-mTOR(S2448)、Akt、mTOR、GAPDH等抗體購自Cell Signaling Technology；羊抗兔IgG II 抗購自Jackson。

2 方法

2.1 細胞培養 細胞培養于含10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素(終濃度為1×105U/L)的RPMI-1640(Gibco)培養液，常規置于37 ℃、5% CO2培養箱中，取對數生長期細胞實驗。

2.2 MTT實驗 實驗分組分為DDP、DDP+低劑量(20 mg/L)PPZ組、DDP+中劑量(40 mg/L)PPZ組、DDP+高劑量(80 mg/L)PPZ組或DDP、DDP+SU11274(0.5 μmol/L)組、DDP+LY294002(0.5 μmol/L)組和DDP+rapamycin(10 nmol/L)組。胰酶消化細胞后接種于96孔板，每孔細胞數為5 000個。孵育12 h后細胞貼壁，吸去培養基，加入含順鉑濃度分別為0、2.5、5、10、20、30、40 μmol/L的順鉑和上述濃度的泮托拉唑鈉、SU11274、LY294002、rapamycin的全血清培養基200 μL，24 h換液1次，處理48 h后，各孔加20 μL MTT 溶液(5 g/L，無菌PBS配制)，繼續培養4 h，吸去培養基，各孔加入150 μL DMSO，搖床避光輕搖10 min，每孔吸100 μL置于另一96孔板內，酶標儀在490 nm處檢測吸光度(A)值，繪制細胞抑制率曲線。每組設5個復孔，實驗重復3次。

2.3 劃痕修復實驗 接種3×105個A549或A549/DDP細胞于6孔板，待細胞融合度為80%時，在板內進行劃痕、拍照。吸去培養基，加入2.5%血清培養基，或含有上述濃度的泮托拉唑鈉及SU11274、LY294002、rapamycin的培養基，處理24 h后在原先拍照的位置進行拍照。劃痕修復率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.4 Transwell實驗 75%乙醇浸泡小室，晾干后于超凈臺內紫外照射30 min備用，常規消化細胞后離心，棄去培養基，PBS清洗2次，用無血清培養基調整細胞密度約為15×104個；上室接種200 μL細胞懸液，下室加600 μL含10% 胎牛血清的培養基；用上述濃度的泮托拉唑鈉、SU11274、LY294002或rapamycin處理細胞，不作任何處理設為對照組；12 h后取出上室，棉簽擦去上室的細胞，甲醇固定20 min，晾干后0.1‰的結晶紫染色45 min，PBS清洗2次；在顯微鏡下隨機取4個視野，拍照并計算穿膜細胞數。

2.5 Western blot 實驗 用RAPI 裂解液提取各組細胞總蛋白并進行蛋白定量，每個泳道上蛋白樣品10 μg，8% SDS-PAGE分離蛋白后，轉印(300 mA、120 min)到PVDF上。5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白室溫封閉1 h。分別加入對應 I 抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入 II 抗孵育2 h后洗膜，加入ECL發光液，凝膠成像系統拍照，分析條帶灰度值。

3 統計學處理

以上實驗均至少重復3次，應用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 肺癌耐順鉑細胞株存在間充質表型及c-Met/AKT/mTOR通路活化

顯微鏡觀察發現，A549細胞呈聚集生長，細胞形態呈卵圓形；A549/DDP細胞生長相對較為分散，細胞體型較大，形態呈長梭形、多角形，見圖1。通過劃痕及Transwell實驗發現， 與A549細胞比較，A549/DDP細胞存在更高的遷移能力(P<0.05)和侵襲能力(P<0.01)，見圖2、3。MTT結果顯示，與A549細胞相比，A549/DDP細胞對順鉑的敏感性更低(P<0.05)，見圖4。Western blot 實驗結果顯示，與A549細胞相比，A549/DDP細胞中E-cadherin相對低表達，vimentin、c-Met、AKT、mTOR相對高表達以及AKT、mTOR磷酸化水平升高(P<0.05)，見圖5。

2 泮托拉唑鈉抑制A549/DDP侵襲、遷移

泮托拉唑鈉可呈濃度依賴性抑制A549/DDP細胞的侵襲和遷移能力，見圖6、7。

Figure 1. The cellular morphology of A549 cells and A549/DDP cells (×200).

圖1 A549細胞和A549/DDP細胞的形態觀察

Figure 2. Different invasion abilities of A549/DDP cells and A549 cells (×100). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsA549 group.

圖2 A549/DDP細胞和A549細胞不同侵襲能力的比較

Figure 3.Different migration abilities between A549/DDP cells and A549 cells (×40). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsA549 group.

圖3 A549/DDP細胞和A549細胞不同的遷移能力

Figure 4. Different cisplatin sensitivity between A549/DDP cells and A549 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsA549 group.

圖4 A549/DDP細胞和A549細胞對順鉑不同的敏感性

Figure 5. The different protein expression levels between A549/DDP cells and A549 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsA549 group.

圖5 不同信號通路相關蛋白水平在A549/DDP細胞和A549細胞中的差異比較

Figure 6.Pantoprazole sodium (PPZ) inhibitied the invasion ability of A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsDDP group.

圖6 泮托拉唑鈉抑制A549/DDP細胞的侵襲能力

3 泮托拉唑鈉逆轉A549/DDP間質表型及順鉑耐藥

鏡下觀察發現，加入泮托拉唑鈉后，A549/DDP細胞的數量減少，形態變得細小，絲狀偽足增加，折光性增強，見圖8。MTT結果顯示，泮托拉唑鈉可顯著增加耐藥細胞株對順鉑的敏感性，并且呈濃度依賴性，見圖9。Western blot 實驗結果顯示，不同濃度泮托拉唑鈉處理細胞48 h后，E-cadherin的表達較無藥物處理組增加，vimentin表達較無藥物處理組減少，見圖10。

4 泮托拉唑鈉抑制c-Met/AKT/mTOR通路活化

Western blot 實驗的結果顯示，泮托拉唑鈉可呈濃度依賴性地下調c-Met、AKT和mTOR的表達，同時抑制AKT和mTOR的磷酸化(磷酸化c-Met沒有檢測出可能與細胞株本身低表達該蛋白有關)，見圖11。

Figure 7. Pantoprazole sodium (PPZ) inhibitied A549/DDP cell migration (×100). Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group.

圖7 泮托拉唑鈉抑制A549/DDP細胞遷移

Figure 8.The effect of pantoprazole sodium (PPZ) on the morphological changes of A549/DDP cells (×200).

圖8 泮托拉唑鈉對A549/DDP細胞形態的影響

5 SU11274、LY294002和rapamycin抑制A549/DDP的侵襲和遷移能力

與對照組相比，加入SU11274、LY294002和rapamycin處理后，A549/DDP細胞的侵襲和遷移能力明顯被抑制 見圖12、13。

6 SU11274、LY294002和rapamycin逆轉A549/DDP間質表型及順鉑耐藥

SU11274、LY294002和rapamycin處理細胞后，A549/DDP細胞的形態由長梭形變為卵圓形，見圖14。MTT結果表明，SU11274、LY294002和rapamycin可顯著增加耐藥細胞株對順鉑的敏感性，見圖15。SU11274、LY294002和rapamycin分別是c-Met、AKT和mTOR抑制劑，可抑制其磷酸化，Western blot 實驗結果顯示，SU11274、LY294002和rapamycin均可上調E-cadherin的表達，下調vimentin的表達，見圖16。

Figure 9.Pantoprazole sodium (PPZ) increased the sensitivity of A549/DDP cells to cisplatin. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group.

圖9 泮托拉唑鈉增加A549/DDP細胞對順鉑敏感性

Figure 10. The effect of pantoprazole sodium (PPZ) on the protein expression of E-cadherin and vimentin in A549/DDP cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group.

圖10 泮托拉唑鈉對A549/DDP細胞E-cadherin和vimentin蛋白表達的影響

Figure 11. Pantoprazole sodium (PPZ) inhibited the c-Met/AKT/mTOR signaling pathway activation in A549/DDP cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group．

圖11 泮托拉唑鈉抑制c-Met/AKT/mTOR通路活化

討 論

質子泵抑制劑是空泡型質子泵(vacuolar H+-ATPases，V-H+-ATPases)的抑制劑，可抑制該泵的活動，逆轉細胞內外pH梯度，是經典的抑酸藥物。缺氧和酸化是腫瘤微環境的重要特征之一，腫瘤細胞通過無氧糖酵解產生大量H+，通過V-H+-ATPases維持胞外環境酸化及胞內中性環境，從而維持腫瘤細胞增殖、遷移及耐藥[11]。近年來許多對該藥物在抗腫瘤方面的研究正是基于對V-H+-ATPases的調控。Lee等[12]發現，V-H+-ATPases在卵巢上皮細胞癌組織中高表達，在癌旁組織中不表達，并且高表達的患者生存期顯著低于低表達患者。通過對多個細胞株的研究發現，V-H+-ATPases在耐藥株中普遍高表達，而質子泵抑制劑可逆轉癌細胞對化療藥物耐藥，同時可協同化療藥物抑制動物耐藥模型中瘤體的生長和瘤內V-H+-ATPases表達。同樣，學者也發現PPIs可通過抑制V-H+-ATPases表達來抑制腫瘤細胞的增殖和轉移[13-14]。

除了對V-H+-ATPases作用以外，PPIs還可通過其它途徑克服腫瘤耐藥，如抑制自噬、調控特異信號通路、逆轉EMT等。王軍等[15]發現泮托拉唑鈉可激活mTOR抑制自噬從而提高胃癌SGC7901細胞株對順鉑的敏感性。Tan等[7]發現泮托拉唑鈉可抑制自噬，增加乳腺癌MCF-7細胞對多西他賽的敏感性。李建琦等[6]發現PPIs可通過抑制PI3K/AKT/mTOR途徑下調細胞內P-gp、MRP1表達，提高耐藥株胞內藥物濃度，逆轉胃癌耐藥。Zhang等[16]發現泮托拉唑鈉可通過抑制AKT/GSK-β/β-catenin途徑抑制胃癌上皮間質轉化，逆轉胃癌對阿霉素的耐藥。而Huang等[17]研究證實PPIs可能是通過抑制STAT磷酸化途徑來逆轉胃癌對順鉑耐藥。此外，Lindner等[18]報道埃索美拉唑抑制食道癌細胞增殖、轉移、增加其對藥物敏感性，可能是通過調控耐藥相關miRNAs來實現的。

上述研究表明，PPIs可通過多種途徑對多種腫瘤細胞發揮強大的藥理作用，但能否對肺癌細胞發揮作用、分子機制如何尚無研究報道。我們的實驗研究發現，肺癌耐順鉑細胞株A549/DDP與敏感株A549相比，存在高侵襲、遷移能力、上皮間質轉化表型和c-Met/AKT/mTOR通路活化的差異。而研究證實上皮間質轉化是腫瘤耐藥的關鍵因素之一，c-Met及其下游PI3K/AKT/mTOR信號既是調控上皮間質轉化的重要途徑，也是導致耐藥的分子機制。Chen等[19]研究發現miR-206可通過抑制和c-Met/PI3K/AKT/mTOR途徑逆轉肺癌上皮間質轉化及順鉑耐藥。Caadas等[20]研究證實，c-Met抑制劑可抑制小細胞肺癌上皮間質轉化，從而克服對化療藥物耐藥。La Monica等[21]發現c-Met擴增可導致非小細胞肺癌發生上皮間質轉化和化療藥物耐藥，吉非替尼可抑制c-Met擴增從而克服上皮間質轉化及耐藥。因此我們假設泮托拉唑鈉可以經過c-Met及其下游途徑來逆轉肺癌細胞上皮間質轉化和順鉑耐藥。

Figure 12. SU11274， LY294002 and rapamycin inhibited the invasion ability of A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsDDP group.

圖12 SU11274、LY294002和rapamycin抑制A549/DDP細胞的侵襲能力

Figure 13. SU11274, LY294002 and rapamycin inhibited A549/DDP cell migration (×40). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsDDP group.

圖13 SU11274、LY294002和rapamycin抑制A549/DDP細胞遷移

Figure 14. The effects of SU11274, LY294002 and rapamycin on the morphological changes of A549/DDP cells (×200).

圖14 SU11274、LY294002和rapamycin對A549/DDP細胞形態的影響

Figure 15. SU11274, LY294002 and rapamycin increased the sensitivity of A549/DDP cells to cisplatin. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group.

圖15 SU11274、LY294002和rapamycin增加A549/DDP細胞對順鉑的敏感性

Figure 16.The effects of SU11274, LY294002 and rapamycin on the protein expression of E-cadherin and vimentin in A549/DDP cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group.

圖16 SU11274、LY294002和rapamycin對A549/DDP細胞E-cadherin和vimentin蛋白表達的影響

我們的研究結果發現通過不同劑量泮托拉唑鈉處理后，A549/DDP細胞的侵襲、遷移能力明顯減弱，同時其對順鉑的敏感性明顯增加，進一步用Western blot 實驗檢測發現，泮托拉唑鈉可顯著增加E-cadherin的表達，下調vimentin的表達，c-Met和AKT和mTOR表達也有下調，AKT和mTOR磷酸化水平被顯著抑制。我們的實驗結果與李建琦等[6]的研究結果相類似，即質子泵抑制劑可抑制AKT、mTOR表達及其磷酸化，但與王軍等[15]的研究結果存在部分出入，其研究結果認為是泮托拉唑鈉是通過激活mTOR抑制自噬水平來逆轉胃癌耐藥。分析原因可能是王軍等使用的是順鉑敏感的胃癌細胞株，而李建琦等采用的是順鉑耐藥的胃癌細胞株，2種細胞株的耐順鉑機制可能是不同的。而本研究采用的是耐順鉑肺癌細胞株，泮托拉唑鈉逆轉其耐藥機制可能是通過抑制mTOR途徑發揮作用。此外mTOR可分為mTORC1和mTORC2兩種復合體，兩者對腫瘤細胞的生長、分化、轉移及自噬有不同的作用機理，在耐藥方面，費世江等[22]通過對比不同肺癌細胞株后發現，基礎狀態下EGFR TKI敏感和耐藥的非小細胞肺癌細胞具有不同的mTOR相關信號通路、Erk及Jak-STAT3信號通路活化狀態。耐藥細胞mTORC2相關信號通路活化明顯高于敏感細胞，且基礎狀態下mTORC2激酶活性在耐藥細胞中也明顯高于敏感細胞。而mTORC1激酶活性在敏感細胞中則較耐藥細胞高，顯示不管是敏感細胞還是耐藥細胞，其mTOR相關信號通路均處于高活化狀態，敏感細胞偏向于mTORC1相關信號通路活化，而耐藥細胞則偏重于mTORC2相關通路異?；罨@示mTORC2和mTORC1之間存在動態平衡。這一研究或許能解釋本研究、李建琦研究與王軍研究結果不一致的部分，但泮托拉唑鈉對mTOR具體機制有待進一步研究。為進一步證實泮托拉唑鈉的分子機制，我們分別使用c-met、PI3K和mTOR特異性抑制劑(可特異性抑制蛋白磷酸化)處理肺癌細胞，發現SU11274、LY294002和rapamycin可以抑制肺癌細胞的侵襲和遷移，增加其對順鉑敏感性，同時可上調E-cadherin表達，下調vimentin表達，這與泮托拉唑鈉的作用是類似的，從而證實泮托拉唑鈉可通過c-Met/AKT/mTOR途徑抑制肺癌細胞侵襲、遷移，逆轉上皮間質轉化及耐藥。我們也注意到，隨著泮托拉唑鈉劑量增加，耐藥株的細胞形態并沒有由長梭形變為卵圓形，而是變得更長、體型變細，絲狀偽足增多，反而趨于上皮間質轉化形態，這與絕大多數文獻報道不一致。這可能是泮托拉唑鈉調控了某些信號通路使細胞骨架發生特異性排布導致的，這種現象及生物學意義有待將來進一步深入研究。綜上所述，泮托拉唑鈉抑制肺癌細胞侵襲、遷移、上皮間質轉化、逆轉順鉑耐藥可能是通過c-Met/AKT/mTOR途徑實現的，這將為臨床治療肺癌、克服耐藥提供新的思路。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Pantoprazole sodium inhibits epithelial-mesenchymal transition and cisplatin resistance in lung cancer cells and underlying mechanism

SONG Jia, WANG Jian, LI Yu, HU Hui-zhen, YAN Jie, WU Li-jun, XU Wei, CHEN Qing-yong

(The117thHospitalofPLA,Hangzhou310013,China.E-mail:CQYong117@163.com)

AIM: To explore the inhibitory effects of pantoprazole sodium on epithelial-mesenchymal transition and cisplatin resistance in lung cancer cells and the underlying mechanism. METHODS: Using MTT method, wound healing assay, Transwell experiment, Western blot, the differences of morphology, invasion ability, migration ability, drug sensitivity and protein expression between A549/DDP cells and A549 cells were determined. The effect of pantoprazole sodium on morphology, invasion ability, migration ability, drug sensitivity and protein expression in A549/DDP cells were also observed. RESULTS: Compared with A549 cells, A549/DDP cells had higher invasion and migration abilities, and lower drug sensitivity, exhibited mesenchymal phenotype and activated c-Met/AKT/mTOR pathway. Pantoprazole sodium inhibited the abilities of invasion and migration, and reversed the mesenchymal phenotype, drug resistance and the c-Met/AKT/mTOR pathway activation in A549/DDP cells. Treatment with c-Met inhibitor SU11274, PI3K inhibitor LY294002 and mTOR inhibitor rapamycin had the same effects on A549/DDP cells as that of pantoprazole sodium. CONCLUSION: Pantoprazole sodium inhibits invasion, migration, epithelial-mesenchymal transition and cisplatin resistance in lung cancer cells by down-regulating c-Met/AKT/mTOR pathways.

Pantoprazole sodium; Lung cancer; Epithelial-mesenchymal transition; Drug resistance

2016- 04- 25

2016- 05- 24

南京軍區醫學科技創新項目(No.14ZD44； No.15MS158)；浙江省科技廳公益性技術應用研究計劃(No.2013C33209； No.2014C33277)；杭州市科技發展計劃項目(No.20130633B29； No.20140633B40)

△通訊作者 Tel： 0571-28084876； E-mail： CQYong117@163.com

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R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.010