缺血預適應對青年與老年大鼠缺血/再灌注心肌氧化應激及線粒體功能的影響*

柴囡楠， 張 昊， 王俊瑩， 李玲旭， 趙雅君△

(1哈爾濱醫科大學病理生理教研室，黑龍江 哈爾濱 150086； 2赤峰學院醫學院，內蒙古 赤峰 024000)

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缺血預適應對青年與老年大鼠缺血/再灌注心肌氧化應激及線粒體功能的影響*

柴囡楠1,2， 張 昊1， 王俊瑩1， 李玲旭1， 趙雅君1△

(1哈爾濱醫科大學病理生理教研室，黑龍江 哈爾濱 150086；2赤峰學院醫學院，內蒙古 赤峰 024000)

目的： 探討缺血預適應(ischemic preconditioning，IPC)對青年與老年大鼠缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，IR)心肌損傷的影響。方法：雄性3月齡(青年)與20月齡(老年)Wistar大鼠，應用離體心臟灌流方法復制心肌IR與IPC模型。實驗分為青年缺血/再灌注(YIR)組、青年缺血預適應(YPC)組、老年缺血再灌注(OIR)組與老年缺血預適應(OPC)組。透射電鏡觀察心肌及心肌線粒體超微結構變化；TTC染色測定心肌梗死面積；比色法測定冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)活性、心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量；酶聯免疫吸附法測定心肌組織硝基化與羰基化蛋白質含量，TUNEL方法檢測心肌細胞凋亡；氧電極法測定線粒體呼吸功能及鈣誘導的線粒體滲透性轉運孔開放情況。結果：與YIR組比較，YPC組心肌梗死面積明顯減少，冠脈流出液中LDH活性降低，心肌組織的SOD活性增加，MDA含量降低，心肌硝基化與羰基化蛋白含量降低。電鏡下可見YPC組心肌及分離的心肌線粒體膜結構完整、基質致密。YIR組心肌線粒體呼吸控制率與Ⅲ態耗氧量及P/O比值均明顯增加，質子漏出減少，鈣誘導的線粒體腫脹明顯減輕，心肌細胞凋亡率下降。而與OIR組比較,OPC組上述指標均無顯著統計學差異。與YPC組比較，OPC組心肌超微結構損傷明顯增加，心肌氧化應激水平增加，線粒體呼吸功能下降，心肌細胞凋亡與壞死增多。結論：缺血預適應能夠保護青年大鼠心肌缺血/再灌注損傷；而老年大鼠心臟對預適應刺激減敏，導致缺血預適應心肌保護作用鈍化，這可能與老齡IPC心臟氧化應激水平增加導致線粒體損傷、細胞凋亡有關。

缺血/再灌注； 缺血預適應； 氧化應激； 線粒體功能； 心肌

隨年齡增加心血管疾病發病率增加，心肌梗死是引起老年人死亡最常見原因，盡早恢復缺血心肌的血液供應能夠挽救缺血心肌，但再灌注可引起心肌發生缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, IR)損傷。缺血預適應(ischemic preconditioning，IPC)是目前已知最有效的減輕心肌IR損傷的內源性保護措施，其機制與短暫的缺血預處理能夠刺激機體產生如腺苷、緩激肽、阿片和氧自由基等內源性保護物質，進而激活膜受體介導的細胞內信號轉導通路，作用于ATP敏感性鉀通道、線粒體滲透性轉換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)等產生心肌保護作用有關[1]。但研究顯示，缺血預適應對成年及老年急性心肌梗死患者的保護作用存在差異[2]。也有研究顯示，缺血預適應不能減少老年哺乳類動物心肌梗死面積[3]，但其具體機制尚不完全清楚。本研究通過觀察缺血預適應處理對青年與老年大鼠缺血/再灌心肌氧化應激、線粒體呼吸功能、細胞凋亡與壞死的影響，以確定IPC處理對青年與老年大鼠心肌IR損傷的保護作用是否存在差異，并探討其可能機制。

材 料 和 方 法

1 動物、主要試劑與儀器

雄性Wistar大鼠購自哈爾濱醫科大學實驗動物中心；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法(terminal dexynu-cleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、心肌線粒體分離試劑盒(碧云天生物技術研究所)；蛋白質硝基化與羰基化檢測試劑盒(Cell Biolabs)。透射電子顯微鏡(H600T)；Clark氧電極(Hansatech)；US-640紫外分光光度計(島津公司)。

2 方法

2.1 大鼠心肌缺血再灌注與心肌缺血預適應模型建立及實驗分組 采用Langendorff離體心臟灌流技術制備心肌IR與心肌IPC模型。大鼠腹腔注射肝素4 000 U使之肝素化，10%水合氯醛(0.04 mL/kg)腹腔注射麻醉后開胸，于距主動脈起始部3～4 mm處迅速剪下心臟，置于冷灌流液中，沖出殘留于冠狀動脈及心臟內的血液，迅速連接在Langendorff離體心臟灌流裝置上，灌流液恒溫在37 ℃并持續用95% O2、5% CO2平衡。實驗分為4組：青年(young, Y)缺血/再灌注組(YIR組)：3月齡Wistar大鼠，體重(280±20)g，離體心臟先預灌平衡20 min，然后在無氧、無灌流液的條件下保持心臟溫度恒定在37 ℃停止灌流30 min，之后復灌30 min；青年缺血預適應組(YPC組)：離體青年大鼠心臟，先預灌注平衡20 min之后，經歷3次5 min缺血與10 min再灌注為缺血預適應處理，之后心臟再經歷30 min的缺血及30 min的再灌注；老年(old,O)缺血/再灌注組(OIR組)與老年缺血預適應組(OPC組):20月齡Wistar大鼠，體重(500±50)g，模型復制同YIR組和YPC組。

2.2 心肌超微結構的觀察 取大鼠左心室約3.0 mm×3.0 mm×1.0 mm大小心尖部組織，置于戊二醛磷酸緩沖液中固定30 min后，將組織切成體積約1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm的小塊4 ℃固定。常規脫水、浸透、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，電鏡下觀察心肌組織超微結構。

2.3 心肌梗死面積的測定 再灌注120 min后取下心臟置于-20 ℃冷凍2 h，然后從心尖到心底方向將心臟切成2～3 mm厚的切片，在1%氯化三苯基四氮唑中37 ℃孵育20 min，再置于10%的甲醛溶液中固定過夜。數碼相機拍照，計算機分析計算梗塞區的面積。

2.4 大鼠冠脈流出液LDH活性測定 心肌缺血后，再灌注開始2 min后收集流出冠脈流出液2 mL，參照試劑盒說明書進行操作處理冠脈流出液，應用紫外分光光度計測定吸光度(A)值，計算出各組LDH活性。

2.5 大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量的檢測 取0.5 g心室肌組織，加入10倍體積預冷的生理鹽水，冰水浴中制成10%組織勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清貯存在-80 ℃直至分析使用。黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性、采用硫代巴比妥酸比色法檢測MDA含量，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，同時采用BCA法測蛋白含量。

2.6 大鼠心肌組織中硝基化與羰基化蛋白含量變化的測定 取心室肌組織稱重，以100 mg組織加400 μL比例加入裂解液，充分裂解后，4 ℃、 12 000 r/min離心30 min，取上清貯存在-80 ℃直至分析使用，采用酶聯免疫吸附實驗法檢測硝基化與羰基化蛋白含量，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，同時采用BCA法測蛋白含量。

2.7 大鼠心肌線粒體呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR)及Ⅲ態與Ⅳ態耗氧量的測定 常規差速離心法提取大鼠線粒體，按試劑盒說明書操作。BCA法測定蛋白含量。用Clark氧電極法測定以蘋果酸為底物的線粒體呼吸控制率、線粒體III態、IV態耗氧量。氧電極反應室設置為溫度25 ℃ ，1 g/L線粒體置于線粒體緩沖溶液中，平衡1 min后，加入底物5 mmol/L丙酮酸和5 mmol/L蘋果酸，線粒體呼吸測定開始加入200 μmol/L的ADP之后記錄線粒體耗氧量為III態呼吸，ADP消耗盡之后的線粒體耗氧量為Ⅳ態呼吸。呼吸控制率為ADP供給充分時線粒體耗氧速率和缺乏ADP時呼吸速率之比，即III態呼吸與IV態呼吸的比值。

2.8 鈣誘導的線粒體滲透轉換孔開放的測定 取1 g/L線粒體，以5 mmol/L丙酮酸和5 mmol/L蘋果酸為底物，每間隔2 min向線粒體緩沖液內加入200 μmol/L CaCl2，記錄520 nm處線粒體吸光度的變化，連續記錄20 min，吸光度值變化反映線粒體腫脹程度，用吸光度值下降的程度來評價鈣誘導的線粒體滲透轉換孔的開放情況。

3 統計學處理

所有數據用均數±標準差 (mean±SD) 表示，應用SPSS 19.0統計軟件處理，組間差異用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學顯著性。

結 果

1 各組大鼠心臟損傷的觀察

1.1 大鼠心肌超微結構改變 透射電鏡下可見，青年缺血/再灌注組心肌肌絲排列紊亂，線粒體基質密度下降、嵴溶解，并可見核染色質凝聚且邊集。青年缺血預適應組心肌肌絲排列整齊，肌節結構清晰，線粒體外膜完整，基質致密，線粒體嵴排列整齊。老年缺血再灌注組心肌肌絲排列紊亂，肌節扭曲，線粒體基質疏松、密度下降，嵴排列紊亂，肌絲間可見脂褐素顆粒。老年缺血預適應組心肌肌絲排列不整齊，線粒體嵴呈絮狀改變，嵴排列紊亂，肌絲間可見大量脂褐素顆粒沉積，見圖1。

Figure 1.Electron microscopic observation of the left ventricular ultrastructure (×10 000). The representative images of the myocardium were showed in young IR group (YIR), young PC group (YPC), old IR group (OIR) and old PC group (OPC).

圖1 透射電鏡觀察大鼠心肌組織超微結構變化

1.2 大鼠心肌梗死面積與冠脈流出液中LDH活性變化 與YIR組比較，YPC組心肌梗死面積明顯降低(P<0.05)，冠脈流出液中LDH活性也明顯降低(P<0.05)。與OIR組比較，OPC組心肌梗死面積及冠脈流出液中LDH活性均無明顯變化。與YPC組比較，OPC組心肌梗死面積明顯增加(P<0.05)，冠脈流出液中LDH活性也明顯升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The changes of the infarct size and the release of LDH. A: the infarct size was expressed as a percentage of the total left ventricle (LV) in YIR, YPC, OIR and OPC groups; B: LDH releases in the coronary effluent fluid in different groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsYIR group;?P<0.05vsYPC group.

圖2 大鼠心肌梗死面積及冠脈流出液中LDH活性的變化

1.3 大鼠心肌組織SOD活性與MDA含量的變化 與YIR組比較，YPC組心肌SOD活性升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)。與OIR組比較，OPC組SOD活力、MDA含量均無明顯變化(P>0.05)。與YPC組比較，OPC組心肌組織的SOD活性明顯降低(P<0.05),MDA含量明顯升高(P<0.05)，見圖3。

1.4 大鼠心肌組織中硝基化與羰基化蛋白含量的變化 與YIR組比較，YPC組心肌組織硝基化與羰基化蛋白含量均明顯降低(P<0.05)。與YIR組比較，OIR組心肌硝基化蛋白含量增加(P<0.05)，而羰基化蛋白含量無明顯變化(P>0.05)。與YPC組比較，OPC組心肌硝基化及羰基化蛋白含量均明顯增加(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.The changes of SOD activity (A) and MDA content (B) in the myocardial tissues in YIR, YPC, OIR and OPC groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsYIR group;?P<0.05vsYPC group.

圖3 大鼠心肌組織SOD活性與MDA含量的變化

Figure 4.The changes of nitrated and carbonylated protein levels in YIR, YPC, OIR and OPC groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsYIR group;?P<0.05vsYPC group.

圖4 大鼠心肌組織硝基化與羰基化蛋白含量變化

1.5 大鼠心肌細胞凋亡分析 與YIR組比較，YPC組心肌細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。與OIR組比較，OPC組心肌細胞凋亡無明顯改變，與YPC組比較，OPC組心肌細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The cardiac myocyte apoptosis determined by TUNEL assay (×400). TUNEL-positive nuclei were stained brown and TUNEL-negative nuclei were stained blue. The apoptotic index was expressed as percentage of TUNEL-positive nuclei. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsYIR group;?P<0.05vsYPC group.

圖5 TUNEL方法檢測心肌細胞凋亡

2 大鼠心肌線粒體結構與功能的變化

2.1 大鼠心肌線粒體超微結構的變化 透射電鏡下可見，YIR組心肌線粒體嵴溶解、基質呈絮狀改變、線粒體呈碎片化。YPC組心肌線粒體嵴結構清晰、基質致密、大部分線粒體膜完整。OIR組和OPC組可見大部分線粒體嵴溶解消失，線粒體呈空泡改變、小的卵圓形線粒體數目增多，并可見脂褐素沉積顆粒，見圖6。

2.2 大鼠心肌線粒體氧化磷酸化效率的評價分析 應用Clark氧電極法檢測線粒體RCR、線粒體的III態與IV態耗氧量、P/O比值及質子漏出情況。結果顯示，與YIR組比較，YPC組心肌線粒體的RCR明顯增加(P<0.05)，線粒體III態耗氧量增加(P<0.05)，P/O比值增大(P<0.05)，質子漏出減少(P<0.05)。與OIR組比較，OPC組心肌線粒體的RCR、線粒體III態耗氧量、P/O比值和質子漏出均無明顯改變。與YPC組比較，OPC組心肌線粒體RCR明顯降低(P<0.05)，線粒體的III態耗氧量降低(P<0.05)，P/O比值減小(P<0.05)，質子漏出增加(P<0.05)，見圖7。

2.3 鈣誘導的大鼠心肌mPTP的開放情況 與YIR組比較，YPC組心肌鈣誘導的線粒體腫脹程度明顯減輕(P<0.05)。與OIR組比較，OPC組心肌鈣誘導的線粒體腫脹程度無明顯改變。與YPC組比較，OPC組心肌鈣誘導的線粒體腫脹程度明顯增加(P<0.05)，見圖8。

討 論

目前已知自由基的爆發式產生是心肌缺血/再灌注的主要發生機制之一，再灌注產生的超氧陰離子與NO反應生成過氧亞硝基陰離子使心肌蛋白質發生硝基化修飾，造成心肌損傷[4]；自由基引發的脂質過氧化反應產生的活性羰基類物質，如丙二醛和丙烯醛等可誘導蛋白質發生羰基化修飾，導致蛋白質功能異常[5]。自由基損傷線粒體電子傳遞鏈，導致能量生成障礙，進一步加重了心肌損傷。缺血預適應處理可通過激活多種細胞信號通路保護青年大鼠心肌缺血/再灌注損傷[6-8]。本研究我們證實，IPC處理通過增加心肌抗氧化能力，抑制心肌蛋白質的硝基化與羰基化反應，抑制再灌注引起的線粒體功能降低，發揮抗青年大鼠心肌IR損傷作用。

目前有研究顯示缺血預適應對成年與老年人心肌梗死的保護作用存在差異[2]；也有文獻報道老年動物和人的心臟喪失了缺血預適應保護作用[9-11]，但

Figure 6.Ultrastructural changes of isolated cardiac mitochondria under transmission electron microscope (×10 000).

圖6 透射電子顯微鏡觀察分離的心肌線粒體超微結構的變化

Figure 7.Mitochondrial oxidative phosphorylation efficiency was evaluated based on mitochondrial respiratory control rate, state III and IV oxygen consumption, the P/O ratio, and proton leakage (oligomycin-inhibited respiration). Respiration was induced with pyruvate/malate (5 mmol/L each) as energizing substrates and ADP (200 μmol/L) to initiate state III respiration. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsYIR group;?P<0.05vsYPC group.

圖7 以丙酮酸為底物的線粒體呼吸控制率、III態與IV態呼吸、P/O比值與質子漏出情況

Figure 8.The opening of mitochondral permeability transition pore induced by calcium.Mitochondria (0.5 g/L) were incubated in standard incubation medium. After 2 min of incubation, the mitochondria were loaded with 200 μmol/L CaCl2. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsYIR group;?P<0.05vsYPC group.

圖8 鈣誘導的線粒體滲透性轉換孔開放情況

其具體機制尚未闡明。本研究顯示，與YPC組比較，OPC組心肌梗死面積明顯增加，心肌損傷標志酶LDH活性增強，心肌抗氧化酶SOD活性降低，脂質過氧化產物MDA產生增加，硝基化及羰基化蛋白質含量增加。透射電鏡下可見OPC組心肌肌絲排列紊亂，線粒體嵴溶解、基質疏松呈絮狀改變，心肌細胞內有大量的脂褐素顆粒沉積。研究提示老齡大鼠心臟對缺血預適應刺激減敏，我們分析這可能與老齡IPC心肌氧化/抗氧化失衡導致心肌活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產生增多，進而使在預適應中發揮保護作用的蛋白質發生氧化、硝基化及羰基化，導致預適應保護作用信號級聯受損有關。氧化應激的過度激活可能在這一病理過程中發揮關鍵作用。有研究顯示，由活性醛(壬烯醛及MDA)介導的羰基化應激增加了老年心臟對缺血/再灌注損傷的易感性[12]；另有報道，心肌蛋白質的硝基化降低了老年心臟的缺血預適應保護作用[13]；這些研究也支持我們的研究結果。

本研究進一步發現，老齡大鼠缺血預適應心肌有大量碎片化及空泡樣改變的線粒體，并可見部分線粒體嵴溶解。與YPC組比較，OPC組心肌線粒體RCR、線粒體Ⅲ態耗氧率及P/O比值均明顯下降，質子漏出、mPTP開放數目和心肌細胞凋亡率均明顯增加，這說明老年缺血預適應心肌線粒體因結構受損而導致功能下降。

線粒體是細胞能量代謝、自由基代謝的調控中心。線粒體功能下降導致線粒體呼吸鏈電子傳遞受阻、質子漏出增加，ROS生成增加，線粒體又是ROS作用的主要靶點，這又進一步加重了線粒體的損傷，導致心肌能量代謝障礙[14]。文獻報道，老年心臟線粒體中包含大量突變的mtDNA，mtDNA突變導致由其編碼的呼吸鏈電子傳遞復合體亞單位功能缺陷，呼吸鏈電子傳遞受阻，線粒體ROS產生增加[15]；老年心肌氧化應激水平增強導致線粒體鈣緩沖能力下降，可導致老年心肌線粒體對鈣損傷的易感性增加，促進心肌細胞通過線粒體途徑介導死亡[16]；老年心臟作用于線粒體的心肌保護信號通路表達下調[17]。目前的研究普遍認為線粒體是IPC心肌保護信號通路作用的末端效應靶點。據此，我們推測，老齡大鼠心臟缺血預適應保護作用鈍化可能與OPC心肌氧化應激水平增強導致線粒體功能下降，線粒體代謝及功能異常反過來又促進了ROS的生成，形成的惡性循環可能使在IPC心肌發揮保護作用的信號通路受損，使作用于線粒體的IPC保護作用的末端效應靶點(如線粒體ATP敏感鉀通道等)受損有關。Adam等[11]也證實，隨增齡心臟結構與生物學功能的改變，導致保護老齡心臟免受缺血損傷的內源性物質減少及信號通路減敏使老年心臟IPC保護效率降低。這與我們的研究結果相一致。

最新研究發現自噬在缺血預適應心臟保護中發揮重要作用[18]。老年心臟自噬水平下降，尤其是線粒體自噬功能受損[19]。本實驗中我們發現OPC心肌線粒體功能明顯下降，線粒體滲透性轉換孔開放數目增加，質子漏出增加，這是否與老齡缺血預適應心肌線粒體自噬水平降低導致損傷的線粒體堆積、進而導致線粒體功能下降有關？目前尚未見報道，這也是我們下一步要探索的問題。

總之，本研究證實老年大鼠心肌缺血預適應保護作用鈍化可能與老年IPC心肌ROS產生增加使線粒體受損，導致線粒體呼吸功能下降，線粒體滲透性轉換孔開放，細胞凋亡有關。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of ischemic preconditioning on oxidative stress and mitochondrial function in young and old rat myocardium with ischemia/reperfusion

CHAI Nan-nan1,2, ZHANG Hao1, WANG Jun-ying1, LI Ling-xu1, ZHAO Ya-jun1

(1DepartmentofPathophysiology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China;2MedicalSchoolofChifengUniversity,Chifeng024000,China.E-mail:zhaoyajun1964@163.com)

AIM: To study the protective effect of ischemia preconditioning (IPC) on ischemia/reperfusion (IR)-damaged myocardium in young and old rats. METHODS: Male Wistar rats aged at 3 months (young) and 20 months (old) were used to establish myocardial IPC model and IR model with the method of Langendorff heart perfusion. The rats were divided into young ischemia/reperfusion (YIR) group, young ischemic preconditioning (YPC) group, old ischemia/reperfusion (OIR) group and old ischemic preconditioning (OPC) group. Transmission electron microscopy was used to observe the ultrastructural changes of myocardial tissue and myocardial mitochondria. The myocardial infarction area was determined by TTC staining. The lactate dehydrogenase (LDH) content in coronary effluent fluid and the levels of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in myocardial tissues were detected by the method of colorimetry. The levels of nitrated and carbonylated proteins in myocardial tissue were measured by ELISA. The myocardial cell apoptosis was analyzed by TUNEL assay. The mitochondrial respiratory function and mitochondrial permeability transition pore opening induced by calcium load were evaluated by oxygen electrode method. RESULTS: Compared with YIR group, the myocardial infarction area in YPC group was obviously smaller, SOD activity in myocardial tissues increased, LDH activity in coronary effluent fluid and the content of MDA decreased, and the levels of nitrated and carbonylated proteins in the cardiac tissues reduced. In YPC group, the mitochondrial membrane structure appeared intact, cristae of the mitochondria showed close arrangement, and the matrix was compressed under the electron microscope. Myocardial mitochondrial respiratory control rate, state Ⅲ oxygen consumption and the P/O ratio in YIR group all significantly increased, proton leak decreased, mitochondrial swelling induced by calcium distinctly reduced, and myocardial apoptosis rate declined. No significant difference of the above indexes between OIR group and OPC group was observed. Compared with YPC group, myocardial ultrastructural damage increased clearly, cardiac oxidative stress increased, mitochondrial respiratory function declined, and cell apoptosis and necrosis increased in OPC group. CONCLUSION: Ischemic preconditioning has protective effect against myocardial IR injury in young rat hearts, while old rat hearts were less sensitive to ischemic preconditioning, leading to bluntness of cardioprotection with IPC in aging hearts. This may be related to mitochondrial injury and severe cellular apoptosis caused by increase of cardiac oxidative stress levels in the aging ischemic preconditioning heart.

Ischemia/reperfusion; Ischemic preconditioning; Oxidative stress; Mitochondrial function; Myocardium

1000- 4718(2016)10- 1737- 07

2016- 06- 02

2016- 06- 30

國家自然科學基金資助項目(No. 81170178)

△通訊作者 Tel: 0451-86699587; E-mail: zhaoyajun1964@163.com

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.002

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