食管鱗狀細胞癌組織中miRNA-375的表達及其臨床意義

陸翰杰 任鐵軍

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食管鱗狀細胞癌組織中miRNA-375的表達及其臨床意義

陸翰杰 任鐵軍

目的 探討miRNA-375表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系。方法 通過實時熒光定量PCR，檢測miRNA-375在67例食管癌及癌旁正常組織的表達。結果 采用循環閾值(ΔCt)對miRNA-375在食管癌和癌旁正常組織中表達量進行定量分析，食管癌組織ΔCt為9.61±1.52，對應正常組織ΔCt為10.86±1.44，其中有80.6%的食管癌組織其表達量低于癌旁正常組織(2-ΔΔCt<1)。結論 miRNA-375低表達可能與食管鱗狀細胞癌的發生、發展、轉移相關。

食管鱗狀細胞癌；miRNA-375；熒光定量PCR

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1587～1589)

食管癌是世界上最常見的消化道腫瘤之一，死亡率居所有腫瘤中第八位[1]。其發病機制仍然不太清楚，目前認為胃食管反流、抽煙等慢性刺激促進上皮細胞的癌變[2]。盡管近年來食管癌的診斷、治療都取得不小的進展，但其5年生存率仍小于15%[3]。因此需要尋找更多、更有價值的生物標記物和治療靶點。

miRNA是1類僅有17～25個核苷酸構成的單鏈、非編碼小RNA分子。它們由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成莖環樣初級miRNA，隨后被RNA酶Ⅲ加工成發夾狀miRNA前體，在胞質中轉換為成熟的miRNA，通過靶向作用于mRNA的3'非翻譯區，造成mRNA的翻譯抑制或者完全降解[4]。因此，miRNA通過下調靶向mRNA的表達參與腫瘤的增殖、分化、凋亡等過程。

有研究認為miRNA-375在胃癌中表達下調，其可通過抑制PDK-1的表達促進腫瘤細胞的凋亡[5]，其在食管癌中研究尚不清楚，本研究通過實時熒光定量PCR驗證差異miRNA-375在67對食管癌及對應正常組織的表達,旨在進一步了解miRNA在ESCC的發生、發展的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

67例ESCC組織及相應的癌旁正常食管組織(距離腫塊組織5 cm以上)來自于河南省林州市人民醫院和林州市腫瘤醫院(2004年-2009年)，所有患者術前均未接受任何放療或化療，術后有詳細的隨訪記錄。其中男性48例，女性19例；年齡≤60歲26例，>60歲41例；髓質型29例，潰瘍型18例，縮窄型7例，蕈傘型13例。分期以國際抗癌聯盟(international union against cancer，UICC)/美國腫瘤聯合會(american joint committee on cancer，AJCC)TNM病理分期第六版為標準。所有組織收集后立即使用液氮冷凍后長期保存于-80 ℃冰箱。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

利用Trizol試劑(Invitrogen公司)裂解提取癌組織和癌旁正常組織RNA，嚴格按照說明書進行操作，并用紫外分光光度計滴定RNA濃度，保證所取RNA OD260/280在1.9～2.1之間，使用無酶水將RNA稀釋至500～1 500 ng/μl。利用TIANGEN的miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑逆轉錄合成cDNA，參加反應的總RNA量為2 μg。

1.3 實時熒光定量PCR

使用ABI 7900HT熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR檢測，選用凱基生物的SYBR Green I 作為熒光染料，選擇miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒，采用12.5 μl的反應體系，擴增條件為熱啟動：95 ℃ 5 min；變性：95 ℃ 15 s；退火:56 ℃ 10 s；延伸：72 ℃ 10 s，共40個循環。根據各個孔熒光信號達到閾值的循環數作為Ct值，以U6為內參，用N=2-△△Ct值表示miRNA-375在食管癌組織及癌旁正常組織表達倍數差異。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 miRNA-375在食管癌組織中的表達

通過溶解曲線可見熒光定量PCR產物特異性好，未出現非特異性擴增，見圖1；擴增曲線可見各樣品均可擴增出目的產物，見圖2。

2.2 miRNA-375在食管癌組織中表達的意義

通過采用循環閾值(ΔCt)對miRNA-375在食管癌和癌旁正常組織表達量進行定量分析，食管癌組織ΔCt為9.61±1.52，對應正常組織ΔCt為10.86±1.44，以N=2-ΔΔCt表示miRNA-375在食管癌組織表達量相對于癌旁正常組織的倍數， N<1表示腫瘤組織中miRNA-375表達水平低于癌旁正常組織，在檢測的67例樣本中，有54例表達水平下調，占總量的80.6%，只有19.4%表達上調，結果有統計學意義，見圖3。

2.3 miRNA-374表達與其臨床病理參數的關系

結果發現，miRNA-374的表達量與腫瘤TNM分期和是否有遠處轉移相關(P<0.05)，與患者年齡、性別及腫瘤病理類型無關，見表1。

圖1 食管癌組織中miRNA-375的熒光定量PCR溶解曲線

圖2 食管癌組織中miRNA-375的熒光定量PCR擴增曲線

圖3 miRNA-375在食管鱗狀細胞癌和癌旁組織中的表達量

3 討論

本研究通過熒光定量PCR技術分析了ESCC組織與相應癌旁組織之間miRNA-375表達量的差異，并在此基礎上探討了miRNA-375的表達與ESCC臨床病理的聯系。

Mi-RNA最早發現于線蟲等低等生物，調控線蟲時序性發育，通過部分或完全的與靶向mRNA的3’非翻譯區(3’UTR)結合，造成mRNA的翻譯抑制或者切割降解，其互補配對的程度越多，造成的翻譯抑制作用越大，完全互補則造成靶向mRNA的完全降解。同一機體在不同時期、不同部位需要不同的蛋白發揮作用，miRNA通過轉錄后調控使體內各種蛋白的表達按需要保持合適的比例，優化了機體對于細胞資源的利用[6]。近年來越來越多的研究顯示，miRNA的異常表達與腫瘤發生存在相關性。有的可以抑制腫瘤細胞增殖、抑制血管生成；而另外一些miRNA則可以誘導癌基因的過度表達，促進腫瘤增殖和轉移。Kumar等[7]的實驗證實miRNA-98位于MYC的上游，可以抑制該基因的表達，從而誘導腫瘤細胞的凋亡，在肺癌和Burkitt淋巴瘤患者體內，miRNA-98表達下調，而使MYC癌基因過度激活，抑制腫瘤細胞的凋亡。有學者[8]通過轉染過表達miR-126載體發現該miRNA可與VEGF-A mRNA的3’非翻譯區(3’UTR)結合，造成VEGF-A表達沉默，抑制血管生成。目前對miRNA-375的研究還不多，Eliasson等[9]通過實驗發現過表達miRNA-375可以抑制胰島素的分泌，卻不影響細胞內Ca2+信號通路。Tsukamoto Y發現miRNA-375在胃癌中表達下調，其可通過抑制PDK-1的表達促進腫瘤細胞的凋亡。

表1 miRNA表達與食管癌臨床病理參數的相關性(例，%)

我們對67對ESCC組織及對應癌旁組織熒光定量PCR檢測，發現miRNA-375在ESCC中呈低表達，明顯低于癌旁正常組織，2組差異有統計學意義(P<0.0001)。通過miRNA-375的表達與臨床病理資料的相關性研究表明，miRNA-375的表達與ESCC的TNM分期和遠處轉移相關，而與年齡、性別及組織類型等無明顯相關，說明miRNA-375表達降低具有更大的轉移能力和侵襲能力。因此我們認為，對miRNA-375的進一步了解有望幫助我們進一步了解食管鱗狀細胞癌的發生、發展，通過對其表達的干預有望為診斷及治療食管鱗狀細胞癌提供新的途徑。

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(編輯：吳小紅)

Expression of miRNA-375 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma Tissues and Its Clinical Significance

LUHanjie，RENTiejun.

LuoyangCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Luoyang,471100

Objective To study the expression of miRNA-375 in esophageal squamous cell carcinoma tissues and its relationship with clinicopathologic characteristics.Methods Real-time quantitative polymerase chain reaction (Real-time PCR) was used to test the expression of miRNA-375 in 67 cases of esophagus cancer and precancerous tissues.Results Quantitative analysis of the expression of miRNA-375 in esophagus cancer and precancerous tissues was detected by ΔCt value,the ΔCt value of esophagus cancer and precancerous tissues were 9.61±1.52 and 10.86±1.44,respectively.Expression of miRNA-375 in 80.6% of esophagus cancer was lower than precancerous tissues(2-ΔΔCt<1).Conclusion The low expression of miRNA-375 might play an important role in the development and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.

Esophageal squamous cell carcinoma;miRNA-375;Real-time PCR

471100 鄭州大學附屬洛陽中心醫院

任鐵軍

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.10.006

R735.1

A

1001-5930(2016)10-1587-03

2015-11-24

2016-07-07)