MiRNA-25在非小細胞肺癌吉非替尼耐藥細胞中的表達及其作用機制

周建英 劉震天 陳穎蘭

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·基礎研究·

MiRNA-25在非小細胞肺癌吉非替尼耐藥細胞中的表達及其作用機制

周建英 劉震天 陳穎蘭

目的 探討miRNA-25在非小細胞肺癌(NSCLC)吉非替尼耐藥細胞中的表達及其作用機制。方法 采用RT-PCR法檢測miRNA-25在NSCLC吉非替尼耐藥細胞PC9/G及親本細胞PC9中的表達；采用體外轉染法將miRNA-25模擬物或抑制物分別轉染PC9和PC9/G細胞，采用CCK8實驗檢測轉染前后細胞對吉非替尼敏感性的變化；并用Westem blot檢測轉染前后細胞中Bim的表達變化。采用雙熒光素酶報告基因驗證miRNA-25是否作用于Bim基因的3'-UTR區(qū)預測靶位。結果 miRNA-25在PC9/G細胞中的表達水平是PC9細胞的(7.15±1.26)倍(P<0.01)。PC9細胞轉染miRNA-25模擬物后，吉非替尼對PC9細胞增殖的抑制率較轉染前明顯下降(P<0.01)，細胞內Bim表達水平較轉染前明顯下降(P<0.05)。PC9/G細胞在轉染miRNA-25抑制物后，吉非替尼對PC9/G細胞增殖的抑制率與轉染前比較明顯增加(P<0.01)，細胞內Bim表達水平較轉染前明顯增高(P<0.05)。經(jīng)雙熒光素酶報告基因驗證Bim是miRNA-25的靶基因。結論 miRNA-25在NSCLC耐藥細胞PC9/G中異常高表達，下調其表達可部分逆轉細胞耐藥性，miRNA-25可能通過作用于Bim參與NSCLC細胞吉非替尼耐藥的發(fā)生和發(fā)展。

非小細胞肺癌；吉非替尼；耐藥；miRNA-25

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1567～1571)

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占全部肺癌的80%左右[1]。近年來，以吉非替尼和厄洛替尼為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs) 逐漸成為治療NSCLC的重要手段[2-3]。但由于存在原發(fā)或獲得耐藥問題， EGFR-TKIs僅對部分NSCLC患者有效。目前這種耐藥機制尚未完全明確[4-5]。

MiRNA是一種廣泛存在于各種生物體中的小RNA分子，可在轉錄后水平負性調控基因的表達。大量的研究證實，miRNA參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，在腫瘤細胞耐藥性形成過程中發(fā)揮著重要作用[6-8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-25參與了腫瘤細胞耐藥形成[9]，但是miRNA-25是否參與了NSCLC細胞EGFR-TKIs耐藥的調節(jié)，目前尚未見報道。因此，本研究以吉非替尼敏感肺癌細胞株PC9與吉非替尼耐藥肺癌細胞株PC9/G為細胞模型，探討miRNA-25是否參與調節(jié)NSCLC吉非替尼耐藥及其可能的分子機制，為臨床NSCLC EGFR-TKIs耐藥的防治提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

NSCLC吉非替尼耐藥細胞PC9/G及親本細胞PC9由本實驗室保存。吉非替尼為美國阿斯利康公司產(chǎn)品；胎牛血清及RPMI 1640為美國Gibco公司產(chǎn)品；細胞蛋白裂解液為北京碧云天公司產(chǎn)品；兔抗人Bim抗體及β-actin抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標記的二抗為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；增強化學發(fā)光試劑盒為美國Pierce公司產(chǎn)品。轉染試劑盒為美國Life公司產(chǎn)品；Prime-scriptTM逆轉錄試劑盒和miRNA熒光定量PCR試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；CCK-8試劑盒為南京凱基生物科技公司產(chǎn)品。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和pGL載體為美國Promega公司產(chǎn)品。miRNA-25 模擬物(mimics)、抑制物(inhibitor)及相應對照均由上海GenePharma公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) NSCLC吉非替尼耐藥細胞PC9/G及親本細胞PC9常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中， 37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。為維持PC9/G細胞耐藥性，向PC9/G細胞培養(yǎng)液中將加入終濃度為2 μmol/L的吉非替尼。

1.2.2 細胞轉染 實驗設置實驗組(miRNA-25 mimics或miRNA-25 inhibitor)、陰性對照組及空白對照組。轉染實驗時取對數(shù)生長期細胞進行細胞轉染，miRNA-25 mimics或miRNA-25 inhibitor的轉染濃度為10 nM，操作步驟按照Lipofectmine 2000轉染說明書進行。

1.2.3 RT-PCR法檢測miRNA-25的表達 采用Trizol試劑提取細胞總RNA，測量濃度后采用Prime-scriptTM逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訳6作為內參，采用SYBR Green法檢測miRNA-25表達，反應體系為25 μl，反應條件為95 ℃ 10 s，95 ℃8 s，65 ℃10 s，70 ℃10 s，共40個循環(huán)。miRNA-25的相對表達量采用2-ΔΔCt法對基因表達量進行相對定量。

1.2.4 CCK8檢測轉染前后細胞對吉非替尼敏感性變化 參照CCK8試劑盒說明書進行實驗。轉染24 h后，以5×103個細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，接種體積100 μl/孔，并設僅含培養(yǎng)基的空白對照。待細胞貼壁后，分別加入終濃度為0.222、0.667、2、6、18、54 μmol/L及0.0056、0.0167、0.05、0.15、0.45、1.35 μmol/L的吉非替尼，每孔加入100 μl。細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將CCK8試劑加入培養(yǎng)孔中，37 ℃條件下培養(yǎng)繼續(xù)孵育2 h，然后在酶標儀上采用450 nm波長測量每孔吸光度(OD)值。繪制細胞生長抑制率曲線，并計算吉非替尼對細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。抑制率計算公式為：生長抑制率=(1-OD用藥組/OD對照組)×100%，以最小二乘法進行曲線擬合，得到IC50值，實驗重復3次。

1.2.5 Westem blot檢測細胞中Bim的含量 轉染48 h后，PBS洗滌細胞，采用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，用BCA法測定總蛋白含量，將樣本按20 μl/孔加入10%聚丙烯酰胺凝膠孔中進行電泳，轉膜后采用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入鼠抗人β-actin抗體及兔抗人Bim抗體，4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，每次10 min，分別加入羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗，孵育后顯影。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測 合成包含有與相應miRNA-25互補結合的靶基因Bim 3'-UTR序列片段和突變的Bim 3'-UTR序列片段，將含突變的Bim 3'-UTR(mutant)的片段和預測miRNA-25結合位點的Bim 3'-UTR克隆到pGL3-Luciferase基因下游的多克隆位點中。將PC9細胞以4×105個/mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，然后采用Lipofectmine 2000試劑共轉染miRNA-25 mimics以及包含Bim 3'-UTR或突變的Bim 3'-UTR的熒光素酶質粒。轉染48 h后收集細胞，按照Promega公司雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行雙熒光素酶活性檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 MiRNA-25在NSCLC細胞中的表達

RT-PCR檢測結果顯示，miRNA-25在吉非替尼耐藥細胞PC9/G中高表達，表達水平為(7.15±1.26)，與本細胞PC9(表達水平1.0)相比，表達水平增高7.15倍，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 轉染前后NSCLC細胞對吉非替尼敏感性變化

我們進一步檢測miRNA-25是否參與調節(jié)NSCLC吉非替尼耐藥。在PC9/G細胞中分別轉染miRNA-25 inhibitor和對照序列；在PC9細胞中分別轉染miRNA-25 mimics和對照序列，采用CCK8實驗檢測轉染前后細胞對吉非替尼敏感性變化。檢測結果顯示，吉非替尼對PC9細胞的IC50為(0.010±0.004)μmol/L，轉染miRNA-25 mimics后吉非替尼對PC9細胞的IC50為(0.042±0.007)μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖1A)。吉非替尼對PC9/G細胞的IC50為(8.74±1.65) μmol/L，轉染miRNA-25 inhibitor后吉非替尼對PC9/G細胞的IC50為(1.78±0.20)μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖1B)。

圖1 PC9/G細胞和PC9細胞分別轉染miRNA-25 inhibitor和miRNA-25 mimics后吉非替尼對細胞的抑制率變化

2.3 Bim是miRNA-25調節(jié)的下游靶基因

利用生物信息學軟件預測miRNA-25下游調節(jié)靶基因，結果提示Bim可能是miRNA-25下游的靶基因。為了驗證miRNA-25與Bim的表達關系，我們采用Western blot技術檢測NSCLC細胞中miRNA-25和Bim的表達水平。檢測結果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，PC9細胞中轉染miRNA-25 mimics后，Bim表達水平顯著下降(P<0.05)(圖2)；與陰性對照組和空白對照組相比，PC9/G細胞中轉染miRNA-25 inhibitor后，細胞內Bim表達水平明顯升高 (P<0.05)。結果表明miRNA-25表達水平與Bim的表達呈負相關。

我們進一步采用雙熒光素酶報告基因技術確認Bim是否為miRNA-25靶基因，檢測結果提示，表達野生型Bim的3'-UTR序列的細胞中，轉染miRNA-25 mimics組與對照組相比熒光素酶活性明顯下降(P<0.01)；轉染突變型Bim的3'-UTR序列的細胞中，轉染miRNA-25 mimics組與對照組相比熒光素酶活性無明顯差異(P>0.05)，以上結果提示，Bim為miRNA-25下游靶基因(圖3)。

3 討論

EGFR-TKI靶向治療相對于傳統(tǒng)化療具有更大的優(yōu)勢，已成為晚期NSCLC的有效治療手段。吉非替尼可抑制腫瘤細胞的生長、繁殖及侵襲等，在EGFR-TKI靶向治療得到廣泛應用。近年來，由于吉非替尼原發(fā)和獲得性耐藥導致其臨床應用受到很大限制，因此，深入研究NSCLC細胞吉非替尼耐藥機制將有助于降低臨床上治療肺癌的難度。目前，越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤細胞原發(fā)或獲得性耐藥過程中發(fā)揮著重要作用[10]。

miRNA-25屬于miRNA 106b～25家族，在食管鱗癌、直腸癌和肝癌等惡性腫瘤中均有高表達[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-25參與了腫瘤細胞耐藥發(fā)生過程，如，Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，下調乳腺癌阿霉素耐藥細胞中miRNA-25的表達水平可顯著降低該細胞對阿霉素的耐藥性。目前研究證實miRNA-25在肺癌組織中高表達，且與患者預后顯著相關[12]，但尚未見有關miRNA-25是否參與肺癌細胞EGFR-TKIs耐藥的研究報道。

圖2 PC9細胞及PC9/G細胞分別轉染miRNA-25 mimics和miRNA-25 inhibitor后細胞中Bim的變化

注：A為Bim 3'-UTR熒光素酶質粒構建示意圖；B為雙熒光素酶報告基因檢測結果，**P<0.01。

在本研究中，我們以NSCLC吉非替尼耐藥細胞PC9/G及親本細胞PC9為研究對象，采用RT-PCR技術檢測這兩種細胞模型中miRNA-25的表達水平，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-25在PC9/G細胞中表達顯著升高。進一步研究發(fā)現(xiàn)下調PC9/G細胞中miRNA-25表達水平可顯著逆轉其吉非替尼耐藥性，而上調親本細胞PC9中miRNA-25表達水平則可顯著促進其對吉非替尼的耐藥水平。由此證實，miRNA-25參與了NSCLC細胞吉非替尼耐藥形成。

我們采用生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，Bim基因的3'-UTR含有能和miRNA-25成熟序列結合的位點，提示Bim可能是miRNA-25的潛在靶基因之一。Bim是Bcl-2家族中僅含一個BH3結構域的蛋白，具有促凋亡活性，在NSCLC、前列腺癌及乳腺癌等惡性腫瘤細胞中均有表達[13]。最近，Zhang等[14]在人卵巢癌細胞模型中發(fā)現(xiàn)Bim介導了miRNA-25對細胞侵襲和凋亡能力的調節(jié)。在肺癌研究中，有研究表明Bim的低表達與EGFR-TKIs不良反應存在相關性[13]；在肺癌細胞中用沉默Bim的表達可降低吉非替尼誘導突變細胞凋亡的能力[15]。

為了深入研究miRNA-25和Bim基因之間的調控關系，我們采用Western blot技術檢測過表達或干擾miRNA-25后Bim基因表達變化，研究結果顯示miRNA-25表達水平與Bim的表達呈負相關，過表達miRNA-25后可顯著降低Bim基因表達水平。我們進一步采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證miRNA-25和Bim基因之間的靶向調控關系，研究證實 miRNA-25可以直接調控Bim基因。在后續(xù)研究中，我們將進一步研究在肺癌細胞中Bim作為miRNA-25的靶基因是否介導了miRNA-25對肺癌細胞耐藥的調節(jié)。

綜上所述，miRNA-25在肺癌吉非替尼耐藥細胞中表達顯著升高，下調miRNA-25表達可部分逆轉細胞耐藥性，這為臨床上干預肺癌細胞EGFR-TKI耐藥提供了新靶點。

[1] Zhou C.Lung cancer molecular epidemiology in China:recent trends〔J〕.Translational lung cancer research,2014,3(5):270-279.

[2] Wallerek S,S?rensen JB.Biomarkers for efficacy of adjuva-

nt chemotherapy following complete resection in NSCLC stages Ⅰ-ⅢA〔J〕.Eur Respir Rev,2015,24(136):340-355.

[3] 肖琳琳，蔡麗芳，廖圣銀，等.EGFR-TKIs維持治療晚期肺腺癌的臨床效果〔J〕.實用癌癥雜志，2016，31(1)：63-66.

[4] Rothschild SI.Targeted therapies in Non-Small cell lung-

Cancer-Beyond EGFR and ALK〔J〕.Cancers (Basel),2015,7(2):930-949.

[5] 隋東江，王蓉美，李偉生，等.吉非替尼治療晚期非小細胞肺癌的療效和毒副作用觀察〔J〕.實用癌癥雜志，2014，29(11)：1486-1488.

[6] Yu DD,Lv MM,Chen WX,et al.Role of miR-155 in drug resistance of breast cancer〔J〕.Tumour Biol,2015,36(3):1395-1401.

[7] Macdonagh L,Gray SG,Finn SP,et al.The emerging role of microRNAs in resistance to lung cancer treatments〔J〕.Cancer Treat Rev,2015,41(2):160-169.

[8] 李智敏，羅喜平，曾俐琴，等.hsa-miRNA27a和hsa-miRNA451通過調控MDR1/P-gp的表達和功能參與卵巢癌和乳腺癌細胞耐藥〔J〕.中國癌癥雜志，2015，25(3)：190-198.

[9] Wang ZY,Wang N,Liu PX,et al.MicroRNA-25 regulates chemoresistance-associated autophagy in breast cancer cells,a process modulated by the natural autophagy inducer isoliquiritigenin〔J〕.Oncotarget,2014,5(16):7013-7026.

[10] Xue J,Niu J,Wu J,et al.MicroRNAs in cancer therapeutic response:Friend and foe〔J〕.World J Clin Oncol,2014,5(4):730-743.

[11] Qu J,Li M,Zhong W,et al.Prognostic role of microRNA-25 in cancers:evidence from a meta-analysis〔J〕.Int J Clin Exp Med,2015,8(8):12921-12927.

[12] 魏益群，李 靜，孫 鋼，等.MicroRNA-25在非小細胞肺癌患者中的異常表達及其臨床意義〔J〕.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2014，29(4)：9-12.

[13] Faber AC,Corcoran RB,Ebi H,et al.BIM expression in treatment-naive cancers predicts responsiveness to kinase inhibitors〔J〕.Cancer Discov,2011,1(4):352-365.

[14] Zhang HY,Zuo Z,Lu X,et al.MiR-25 regulates apoptosis by targeting Bim in human ovarian cancer〔J〕.Oncol Rep,2012,27(2):594-598.

[15] Li Z,Zhou S,Zhang L,et al.BIM induction of apoptosis triggered by EGFR-sensitive and resistance cell lines of non-small-cell lung cancer〔J〕.Med Oncol,2011,28(2):572-577.

(編輯：甘 艷)

Expressions of Micro RNA-25 in Gefitinib-resistant Non-small Cell Lung Cancer Cells and Its Mechanism

ZHOUJianying,LIUZhentian,CHENYinglan.

JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Objective To investigate the expression of microRNA-25 (miRNA-25) in gefitinib-resistant non-small cell lung cancer cells and its mechanism.Methods Real-time PCR (RT-PCR) was used to detect the expression of miRNA-25 in gefitinib-resistant non-small cell lung cancer cells line PC9/G and its parent cells line PC9.miRNA-25 mimics and miRNA-25 inhibitor in vitro were transiently transferred into PC9 and PC9/G cells respectively.The expression level of miRNA-25 was detected by RT-PCR.Cell viability was analyzed by CCK8 assay.Expression of Bim protein was detected by western blot.Bioinformatics software predicted the potential target genes of miRNA-25 and dual luciferase reporter gene was used to analyze the binding between miRNA-25 and 3'-UTR of Bim.Results The expression level of miRNA-25 was up-regulated in PC9/G cells as compared with PC9 cells (P<0.01).Over-expression of miRNA-25 inhibited gefitinib chemosensitivity (P<0.01),and the up-regulation of miRNA-25 led to a significant decrease in the Bim protein levels (P<0.05).Low-expression of miRNA-25 promoted gefitinib chemosensitivity (P<0.01),and the down-regulation of miRNA-25 led to a significant increase in the Bim protein levels (P<0.05).Dual luciferase reporter gene assay indicated that miRNA-25 regulated Bim expression by binding to the 3'-UTR of Bim mRNA.Conclusion The expression of miRNA-25 is up-regulated in PC9/G cells.Down-regulation of the expression of miRNA-25 can partially reverse the gefitinib-resistance.miRNA-25 may play a vital role in drug resistance by targeting Bim.

Non-small cell lung cancer;Gefitinib;Drug resistance;MiRNA-25

江西省衛(wèi)生廳科技計劃資助項目(編號：20131206)

330029 江西省腫瘤醫(yī)院

劉震天

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.10.001

R734.2

A

1001-5930(2016)10-1567-05

2016-04-29

2016-06-22)