K 33位乙酰化修飾SUMO蛋白的化學合成

王業海，孔一夫，陳晨晨2，李宜明

（1.合肥工業大學生物與醫學工程學院，合肥230009；2.中國科學院強磁場科學中心，合肥230031）

K 33位乙酰化修飾SUMO蛋白的化學合成

王業海1，孔一夫1，陳晨晨2，李宜明1

（1.合肥工業大學生物與醫學工程學院，合肥230009；2.中國科學院強磁場科學中心，合肥230031）

采用高溫輔助固相合成技術及基于多肽酰肼的自然化學連接技術，高效獲得了小泛素相關修飾物（SUMO）蛋白及33位賴氨酸（K33）乙酰化SUMO蛋白.聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）和圓二色光譜分析結果表明，與生物表達蛋白相比，化學合成蛋白具有較好的純度和類似的二級結構.

小泛素相關修飾物；乙酰化；高溫輔助固相合成；多肽酰肼；自然化學連接

在真核細胞中小泛素相關修飾物（SUMO）修飾已經成為調控蛋白質功能的一種關鍵翻譯后修飾［1～6］.研究發現，數以百計的蛋白可以被 SUMO化［7～9］，SUMO化蛋白進而參與到染色質的組裝、DNA的修復、蛋白質的體內平衡和信號轉導等生理過程中［10，11］.與蛋白質泛素化類似，蛋白質的SUMO化同樣需要E1激活酶、E2結合酶和E3連接酶等3種酶的參與［12］.這3種酶的協同作用使底物蛋白SUMO化，而底物蛋白的SUMO化位點主要發生在一段收斂的ΨK x D／E（Ψ代表疏水性氨基酸；x代表任意氨基酸）序列的賴氨酸上［13］.

SUMO化蛋白的識別主要是通過SUMO與其效應蛋白上SUMO相互作用基序（SIM域）的非共價相互作用來實現［14～16］.SIM是一段少于10個氨基酸的多肽序列，包含1個以3～4個氨基酸為核心的疏水序列（主要是Val或者Ile）和1個鄰近的酸性區域［17］.SIM中的疏水殘基會結合SUMO結構中的β2股，并且會使β折疊延伸.SIM中的酸性殘基通過結合SUMO蛋白表面上的酸性區域來增加SIM與SUMO蛋白的結合力.SUMO化蛋白與效應蛋白SIM域的正確識別是SUMO化蛋白發揮正常功能的關鍵.

SIM中的一些Ser或Thr可以被磷酸化，磷酸化后的SIM則可通過電荷相互作用增強其與SUMO化蛋白的結合力［18～20］；SUMO蛋白可以被乙酰化，乙酰化后的SUMO蛋白與SIM的結合力則大幅度降低［21］.SUMO蛋白與SIM之間的這種精細化調控是SUMO化蛋白相關功能得以正常發揮的重要保證.

與磷酸化SIM的制備相比，制備大量、性質均一的乙酰化SUMO則要困難得多.目前，制備乙酰化SUMO蛋白的主要方法為通過非天然氨基酸定點嵌入方法將乙酰化Lys嵌入到SUMO蛋白中，或通過酶促反應，體外獲得乙酰化SUMO蛋白［22］.這2種方法都難以獲得大量的乙酰化SUMO蛋白.近年來，由于多肽固相合成及片段連接技術的發展，使得蛋白質化學合成成為一種高效獲得翻譯后修飾蛋白的方法［23～34］.尤其是高溫輔助的Fmoc固相多肽合成技術有助于一次性合成序列較長的多肽片段［35］.基于此，本文以高溫輔助的Fmoc固相合成技術結合基于多肽酰肼的自然化學連接方法，將乙酰化SUMO蛋白分成兩片段合成，然后將兩片段肽連接獲得全長蛋白，合成路線如Scheme 1所示.

Scheme 1 Am ino acid sequence of SUMO2（A）and the synthesis strategy of SUMO2 and K 33?Ac?SUMO2（B）

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

20種Fmoc氨基酸、Fmoc?Nle?OH和6?氯苯并三氮唑?1，1，3，3?四甲基脲六氟磷酸酯（HCTU）購自吉爾生化（上海）有限公司；N，N′?二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、N，N′?二異丙基乙胺（DIEA）、三氟乙酸（TFA）、甲醇、苯酚和乙腈均為分析純，巰基乙酸甲酯（純度為96%），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；哌啶、乙醚和水合肼均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；三苯基甲基氯樹脂（取代度為0.43mmol／g）和Rink酰胺樹脂（取代度為0.34 mmol／g）購自天津南開和成科技有限公司；2?肟氰乙酸乙酯（Oxyma，純度為98%）和N，N′?二異丙基碳二亞胺（DIC，純度為99%）購自安耐吉化學公司.

Centrifuge 5424型離心機（德國艾本德股份公司）；FE20?K?Plus型pH計（瑞士梅特勒?托利多公司）；SHB?Ⅲ型臺式循環水式多用真空泵（鄭州長城儀器有限公司）；FD?1A?50型冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；IKA C?MAG SH7型磁力攪拌器［德國艾卡（廣州）儀器設備有限公司］；ME103E型分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；LC?20AT型高效液相色譜（HPLC）儀（日本島津公司）；Ultimate XB?C18型分析型色譜柱（φ250 mm×4.6 mm，美國格雷斯公司）；Ultimate XB?C18型半制備型色譜柱（φ250 mm×10 mm，美國格雷斯公司）；安捷倫1100型液相色譜?質譜聯用儀（美國An?glient公司）；J?1100型圓二色光譜（CD）儀（香港佰泰科技有限公司）.

1.2 酰肼樹脂的制備

將2 g三苯基甲基氯樹脂（0.86 mmol）溶于30 mL DMF／DCM（體積比1∶1）混合溶劑中，加入8.6 mmol水合肼和17.2 mmol DIEA，冰浴條件下反應12 h；加入2 mL甲醇封閉未反應掉的三苯基甲基氯樹脂；反應結束后，依次用DMF、水、甲醇和乙醚洗滌得到的酰肼樹脂，風干并置于4℃冰箱中備用（經測定酰肼樹脂的取代度為0.38 mmol／g）.

1.3 小泛素相關修飾物第一片段（SUMO2?1）的制備

將263.1mg酰肼樹脂置于固相合成管中，用15 mL DMF／DCM混合溶劑（體積比1∶1）溶脹15min后抽干，采用高溫輔助的Fmoc固相合成法合成SUMO2?1（0.4 mmol氨基酸＋0.4 mmol Oxyma＋0.4 mmol DIC），反應時間為20～30 min，反應溫度為75℃.其中，精氨酸（Arg）采用HCTU作為縮合劑，室溫下反應40 min，反應2次；組氨酸（His）采用DIC作為縮合劑，室溫下反應40 min；半胱氨酸（Cys）采用DIC作為縮合劑，50℃反應40 min.反應完畢，依次用DMF，DCM和DMF各洗滌5次，加入含有哌啶（體積分數20%）的DMF溶液反應2次（反應時間分別為2和10 min），脫除Fmoc保護基.組裝完肽鏈后，向多肽合成管中加入8 mL切割試劑［V（TFA）∶V（苯酚）∶V（水）∶V（三異丙基硅烷，TIPS）＝88∶5∶5∶2］，反應2 h，將多肽從樹脂上切下，并脫除側鏈保護基團.將切割液置于離心管中，

用N2氣鼓泡，濃縮溶液，最后用冰乙醚沉淀，離心，得到粗肽，經LC?MS分析確定是否為目標產物，使用半制備型HPLC分離得到SUMO2?1（110 mg，分離產率20.8%）.

1.4 K 33乙酰化小泛素相關修飾物第一片段（K 33?Ac?SUMO2?1）的制備

將263.1mg酰肼樹脂置于固相合成管中，用15mLDMF／DCM混合溶劑（體積比1∶1）溶脹15min后抽干；采用高溫輔助的Fmoc固相合成法合成K33?Ac?SUMO2?1.每一種氨基酸耦合的合成步驟與SUMO2?1相同，不同之處在于第33位的Lys采用側鏈氨基Alloc保護的Fmoc氨基酸進行耦合.當所有氨基酸耦合完成后，先用四（三苯基膦）鈀（0.01mmol）脫除K33位賴氨酸上的Alloc保護基（反應2次，每次30 min）；沖洗過后再加入乙酸酐試劑（1 mL乙酸酐＋1 mL DIEA＋8 mL DMF）對K33進行乙酰化修飾，反應10 min后，將肽鏈末端的Fmoc保護基用哌啶脫除掉.最后，將多肽從樹脂上切割下來，采用相同的后處理過程得到粗肽，經LC?MS分析確定是否為目標產物，使用半制備型HPLC分離得到K33?Ac?SUMO2?1（106 mg，分離產率19.8%）.

1.5 小泛素相關修飾物第二片段SUMO2?2的制備

將294 mg Rink酰胺樹脂置于固相合成管中，用15 mL DMF／DCM混合溶劑（體積比1∶1）溶脹15 min后抽干；采用高溫輔助的Fmoc固相合成法合成SUMO2?2.每一種氨基酸耦合的合成步驟與SUMO2?1相同.加完所有氨基酸后，將多肽從樹脂上切割下來，采用相同的后處理過程得到粗肽，經LC?MS分析確定是否為目標產物，使用半制備型HPLC分離得到SUMO2?2（95 mg，分離產率17.9%）.

1.6 SUMO2?1與SUMO2?2肽片段連接

參照文獻［36～38］方法，將26.3 mg SUMO2?1用PBS緩沖液（6.0 mol／L Gn·HCl，0.2 mol／L Na2HPO4）溶解，在－10℃，pH＝3.0條件下用亞硝酸鈉氧化，得到酰基疊氮產物，再加入巰基乙酸甲酯（MTG），調節pH值至7.0，得到SUMO2?1硫酯；加入39.7 mg SUMO2?2，用分析型HPLC監測反應；待完全轉化為SUMO2后，經LC?MS分析確定是否為目標產物，用半制備型HPLC分離，凍干，得到全長的SUMO2蛋白（24 mg，分離產率45.6%）.

1.7 K 33?Ac?SUMO2?1與SUMO2?2肽片段連接

將26.5 mg K33?Ac?SUMO2?1用PBS緩沖液溶解，在－10℃，pH＝3.0條件下用亞硝酸鈉氧化，得到酰基疊氮產物；再加入巰基乙酸甲酯（MTG），調節pH值至7.0，得到K33?Ac?SUMO2?1的硫酯；加入39.7 mg SUMO2?2，用分析型HPLC監測反應；待完全轉化為K33?Ac?SUMO2后，經LC?MS分析確定是否為目標產物，用半制備型HPLC分離，凍干，得到全長的K33?Ac?SUMO2蛋白（21mg，分離產率39.7%）.

2 結果與討論

2.1 SUMO2肽片段的合成與HPLC表征

實驗中嘗試采用標準的Fmoc固相合成方法合成SUMO2肽片段.將所需的氨基酸（0.4 mmol）、2?（7?偶氮苯并三氮唑）?N，N，N′，N′?四甲基脲六氟磷酸酯（0.36 mmol）和 N，N′?二異丙基乙胺（0.8 mmol）依次加入合成管中反應生成SUMO2肽片段，由于片段過長導致合成效果并不理想.在Fmoc固相合成方法中，高溫可以提高氨基酸之間的耦合效率，進而提高長片段多肽合成產率，因此本文采用該方法合成SUMO的2個片段.通過這種方法制得了純度較高的2個片段的粗肽，但質譜分析發現所得到的產物并不是SUMO2?1和SUMO2?2.經過分析發現，相比于正常肽片段每個產物的分子量都多32.由于甲硫氨酸（Met）易于氧化，且每條肽片段都含有2個Met，故推測是在合成過程中Met發生了氧化.因此，采用正亮氨酸（Nle）替代Met來獲得正確的多肽片段［24］.經過改進獲得了純度較高的粗肽產物，HPLC分析結果如圖1所示.雖然乙酰化片段1的純度比天然片段略有下降，但整體產率依然較好（SUMO2?1產率20.8%，K33?Ac?SUMO2?1產率19.8%，SUMO2?2產率17.9%）.

2.2 SUMO2的獲得與HPLC表征

Fig.1 HPLC trace（A，B，C）and MS（D，E，F）of SUMO2?1（A，D），K 33?Ac?SUMO2?1（B，E）and SUMO2?2（C，F）

在獲得SUMO2肽片段后，利用基于多肽酰肼的自然化學連接方法進行肽片段的連接.首先，使用MPAA作為硫醇試劑進行肽片段的連接，經過4～5 h的反應即可獲得連接產物.但在隨后的分離過程中發現，產物SUMO2的出峰位置與MPAA的出峰位置重合，調整分離梯度后依然無法將兩者分開.為了解決這個問題，使用MTG作為反應的硫醇試劑進行肽片段的連接［24］.經過5～6 h反應，獲得了全長的SUMO2產物（產率45.6%），HPLC分析結果如圖2所示，并且在后續的分離純化過程中并未受到硫醇出峰的影響.

2.3 K 33?Ac?SUMO2的獲得與HPLC表征

以MTG作為硫醇試劑，通過兩片段多肽酰肼連接反應，獲得了目標K33?Ac?SUMO2蛋白（產率39.7%），圖3示出了HPLC分析結果.同樣，使用MTG作為硫醇可使產物的分離較為順利.

Fig.3 Ligation trace of K 33?Ac?SUMO2?1（A）and SUMO 2?2（B），and MS（C）of K 33?Ac?SUMO 2

2.4 SDS?PAGE分析

通過SDS?PAGE鑒定了SUMO和K33?Ac?SUMO蛋白是否具有正確的分子量.由圖4可知，化學全合成的SUMO及K33?Ac?SUMO蛋白與生物表達的SUMO蛋白處在同一位置，且具有較好的純度.

Fig.4 SDS?PAGE of expressed SUMO 2（1），syn?thesized SUMO2（2）and synthesized K 33?Ac?SUMO2（3）

2.5 圓二色光譜（CD）分析

利用圓二色光譜（CD）鑒定了SUMO蛋白和K33?Ac?SUMO蛋白是否具有正確的二級結構.將合成蛋白溶于水中使其自發折疊，調節濃度至0.5～1 mg／mL用于CD測試.由圖5可知，化學全合成的SUMO蛋白和K33?Ac?SUMO蛋白與生物表達的SUMO蛋白在溶液中具有類似的二級結構.

Fig.5 CD spectra of exp ressed SUMO 2，synthe?sized SUMO2 and synthesized K 33?Ac?SU?MO2

3 結 論

采用高溫輔助的Fmoc固相多肽合成方法，結合多肽酰肼連接技術以兩片段高效合成了SUMO2蛋白與K33?Ac?SUMO2蛋白.通過與生物表達SUMO2的SDS?PAGE和CD數據進行分析比較，證明了合成蛋白具有較好的均一性與類似的二級結構.本文通過化學合成的策略獲得了含有翻譯后修飾的SUMO2蛋白，為研究乙酰化SUMO2與底物蛋白SIM的相互作用提供了重要的基礎.除SUMO蛋白外，泛素蛋白也含有類似的乙酰化及磷酸化修飾［39，40］，這些翻譯后修飾發揮了重要的生理功能.該合成策略的成功應用也為高效獲得含有類似翻譯后修飾的泛素蛋白提供了有效的途徑.

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Chem ical Synthesis of K33 Acetylated SUMO Protein?

WANG Yehai1，KONG Yifu1，CHEN Chenchen2，LIYiming1?
（1．School ofBiological and Medical Engineering，Hefei University of Technology，Hefei230009，China；2．High Magnetic Field Laboratory of the Chinese Academy ofSciences，Hefei230031，China）

Sumoylated protein was found to reduce the protein binding force with the SUMO?interaction motif （SIM）of effector protein when K33 of SUMO was acetylated.To further study the structures and mechanism，a large amount of uniformity acetylated SUMO protein was greatly needed.In this work，SUMO protein and K33 acetylated SUMO protein was efficiently obtained using high temperature assisted solid?phase peptide syn?thesis（SPPS）technology combined with peptide hydrazide ligation.SUMO and K33 acetylated SUMO was identified with corrected molecularweightby the SDS?PAGE.Itwas also confirmed that the chemically synthe?tic protein and biologically expressed SUMO2 own similar homogeneity and secondary structure by the CD analysis.These results provided a foundation for the follow?up study of K33 acetylated SUMO protein.

Small ubquitin?related modifier；Acetylation；High temperature assisted solid?phase peptide syn? thesis；Peptide hydrazide；Native chemical ligation

O629

A

10.7503／cjcu20160417

（Ed.：P，H，W，K）

?Supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.21372058，21572043）.

2016?06?12.

日期：2016?10?19.

國家自然科學基金（批準號：21372058，21572043）資助.

聯系人簡介：李宜明，男，博士，副教授，主要從事翻譯后修飾蛋白的化學合成、結構及功能方面的研究. E?mails：lym2007@mail.ustc.edu.cn；ymli@hfut.edu.cn