采用大分子單體穩定印跡牛血清白蛋白

錢立偉，李 季，宋文琦，胡小玲，管 萍

（1.陜西科技大學輕工科學與工程學院，西安710021；2.西北工業大學理學院，西安710072）

采用大分子單體穩定印跡牛血清白蛋白

錢立偉1，李 季2，宋文琦2，胡小玲2，管 萍2

（1.陜西科技大學輕工科學與工程學院，西安710021；2.西北工業大學理學院，西安710072）

以牛血清白蛋白為模板蛋白質，聚（丙烯酸羥乙酯?乙烯基咪唑?1?（烯丙基乙酯）?3?乙烯基咪唑氯）［P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）］為大分子功能單體和交聯劑，通過氧化還原引發聚合法制備了蛋白質印跡水凝膠.圓二色光譜和同步熒光光譜結果表明，P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）能夠較好地維持牛血清白蛋白結構穩定性，而相同質量的HEA，VIM和氯化1?（烯丙基乙酯）?3?乙烯基咪唑（［AVIM］Cl）的混合物對牛血清白蛋白的結構破壞嚴重.選擇性吸附和競爭吸附的結果表明，用P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）制備的印跡水凝膠比用HEA，VIM和［AVIM］Cl制備的印跡水凝膠具有更強的選擇性和識別能力.在制備過程中維持模板蛋白質結構的穩定性有利于得到具有高識別能力和選擇性的印跡聚合物.采用大分子單體印跡蛋白質的方法，可以有效地克服蛋白質在印跡過程中的結構容易變性的缺點，對蛋白質印跡技術的發展具有重要意義.

分子印跡技術；蛋白質印跡；蛋白質結構穩定；圓二色光譜；同步熒光光譜

分子印跡技術是分析化學領域熱門的課題之一，其中生物小分子模板的印跡技術發展已經十分純熟［1，2］，而生物大分子［3］特別是蛋白質和酶的印跡技術卻發展得相對緩慢.這主要是由于蛋白質在印跡過程中結構易變，導致制備的印跡聚合物識別性大幅下降.

Krysico等［4，5］認為，蛋白質在印跡過程中結構易變是由傳統功能單體和交聯劑的破壞引起的.研究發現，在牛血清白蛋白、溶菌酶和牛血紅蛋白溶液中分別加入傳統的小分子功能單體和交聯劑后，蛋白質的二級結構會發生大幅度改變，當這些功能單體的濃度遠低于制備傳統蛋白質分子印跡聚合物所需的用量時，蛋白質的二級結構依然遭到嚴重破壞.在以傳統小分子功能單體和交聯劑制備的分子印跡聚合物中，由于模板分子結構的改變，其印跡孔穴的識別性大幅降低，這也是大部分蛋白質分子印跡聚合物的選擇性和識別性都遠低于以小分子為模板的分子印跡聚合物的主要原因.

研究發現，傳統功能單體和交聯劑因具有分子體積小及分子運動靈活的特點而容易進入蛋白質內部，從而影響維持蛋白質結構穩定的氫鍵，從而導致蛋白質結構的破壞［Scheme 1（A），（B）］［6，7］.與之相比，大分子單體由于其分子體積較大、分子運動較為不靈活，只能與蛋白質表面的官能團進行作用［Scheme 1（C），（D）］，因而能夠有效地維持蛋白質結構的穩定性，有助于提高蛋白質印跡聚合物的識別能力.

為進一步驗證采用大分子單體穩定印跡蛋白質方法的普適性，并深入研究大分子單體與蛋白質之間的作用機理，本文以丙烯酸羥乙酯（HEA）、乙烯基咪唑（VIM）和氯乙酸丙烯酯（Aca）為反應單體，通過無規共聚反應和烷基化反應，制備了大分子單體聚（丙烯酸羥乙酯?乙烯基咪唑?1?（烯丙基乙酯）?3?乙烯基咪唑氯）［P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）］，采用圓二色光譜和同步熒光光譜研究了P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）和其組成小分子單體混合物［即HEA、VIM和氯化1?（烯丙基乙酯）?3?乙烯基咪唑（［AVIM］Cl）］對模板蛋白質二級結構和其內部微環境的影響，采用吸附等溫實驗、選擇性吸附和競爭吸附實驗研究了印跡水凝膠的吸附機理和識別能力，得到印跡過程中蛋白質結構穩定性與印跡聚合物識別性之間的重要關系.

Scheme 1 Influence ofmacromolecular chain and m icromolecular monomer on the conformation of template protein［6，7］

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

丙烯酸羥乙酯（HEA）、1?乙烯基咪唑（VIM）和氯乙酸丙烯酯（ACa），Alfa Aesar化學試劑公司；牛血紅蛋白（Hb，Mw＝64500，p I＝6.8～7.0）、溶菌酶（Lyz，Mw＝14400，p I＝10.7）、卵清白蛋白（OVA，Mw＝45000，p I＝4.7）和牛血清白蛋白（BSA，Mw＝66400，p I＝4.8），Sigma公司（St.Louis，MO，USA）；N，N，N，N?四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（APS）和2，2?偶氮二異丁腈（AIBN），天津科密歐化學試劑公司；蛋白質分子量標記，上海金穗生物技術有限公司.

TENSOR27型傅里葉變換紅外光譜（FTIR）儀，德國布魯克公司；Avance 300 MHz型核磁共振氫譜（1H NMR）儀，德國布魯克公司；Kratos Axis Ultra DLD型X射線光電子能譜（XPS），日本島津公司；Cary?1E型紫外?可見（UV?Vis）分光光度計，美國瓦里安公司；Inca Oxford型掃描電子顯微鏡（SEM），英國牛津儀器有限公司；Chirascan型圓二色光譜（CD）儀，英國應用光物理公司；F?4500型熒光光譜儀，日本 Hitachi公司；50C型凝膠滲透色譜（GPC），美國Waters公司；DYY?6C型電泳儀，北京六一廠.

1.2 P（HEA?co?VIM）和P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）的合成

將1.4mL（10.9mmol）HEA和0.6mL（6.1mmol）VIM加入10mL乙醇中，再加入20mg AIBN，超聲溶解5 min，并通N2氣15 min后，于70℃反應6～12 h，用乙醚沉淀并洗滌，產物于50℃真空干燥1 h，得到P（HEA?co?VIM）.

將3 g P（HEA?co?VIM）溶于8 mL DMF中，在50℃下通過恒壓滴液漏斗加入0.6 mL ACa（4.0 mmol），反應18 h，用20 mL乙醚沉淀產物，得到淡黃色黏稠固體P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）粗產物.粗產物用100 mL乙醚多次洗滌后溶于5 mL去離子水中，用截留分子量為20000的透析袋透析3 d，水溶液經過冷凍干燥，得到1.7 g P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）.

1.3 氯化1?（烯丙基乙酯）?3?乙烯基咪唑離子液體的合成

在25℃下，將2.69 g（20mmol）ACa溶于10mL丙酮中，加入1.88 g（20mmol）VIM，于40℃磁力攪拌10～12 h，溶液分為兩相；通過分液漏斗收集上層溶液，并用20 mL丙酮洗滌，將得到的固體用10 mL水溶解，并通過冷凍干燥得到氯化1?（烯丙基乙酯）?3?乙烯基咪唑（［AVIM］Cl），產率86%，圖1給出［AVIM］Cl的1H NMR譜圖.

1.4 BSA印跡水凝膠的制備

將66mg BSA和0.8mL磷酸緩沖液（0.01mol／L，pH＝7.0）加入φ25mm×40mm的稱量瓶中，再加入132.8 mg P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）和2 mg APS，于25℃預聚合20min，通入N2氣15 min，再快速加入2μL TEMED，密封后于25℃反應3 h；反應完成后，將生成的印跡水凝膠（MIH）用打孔器打成φ6 mm×1.5 mm的圓片.將MIH樣品在25℃下浸泡在100 mL 0.5 mol／L的NaCl溶液中進行洗

脫，直到在紫外?可見光譜中觀察不到洗脫液中模板蛋白質的特征吸收峰.當完全洗脫模板蛋白質后，用去離子水除去水凝膠中殘留的NaCl，將凝膠片進行冷凍干燥.將BSA印跡水凝膠命名為MIH?C?BSA［其中C代表P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）］.

Fig.11H NMR spectrum of［AVIM］Cl in CDCl3

采用相同的方法制備非印跡水凝膠（NIH），并在其合成過程中不加入模板蛋白質.制備的非印跡水凝膠命名為NIH?C?BSA.

用86.9mg HEA，10mg VIM和35.9mg ［AVIM］Cl代替132.8 mg P（HEA?co?VIM? co?［AVIM］Cl），制備基于小分子單體的印跡和非印跡水凝膠，分別命名為MIH?M?BSA和NIH?M?BSA（其中M代表小分子單體）.

1.5 分子印跡水凝膠的吸附

在25℃下，將50 mg凝膠干片在磷酸緩沖液（0.01 mol／L，pH＝7.0）中溶脹平衡，將凝膠片轉移至0～1.2 mg／mL BSA的磷酸緩沖溶液中吸附3 h；收集吸附后的BSA溶液，通過紫外?可見分光光度法檢測其吸光度.凝膠干片對蛋白質的吸附量（Q）通過Q＝（c0－ce）V／m計算，其中c0（mg／mL）和ce（mg／mL）分別為BSA溶液的初始和吸附后的濃度，V（mL）為蛋白質溶液的體積，m（g）為水凝膠干片的質量.用印跡因子（IF）［IF＝QMIH／QNIH，其中，QMIH和QNIH分別是MIH和NIH對蛋白質的吸附量］衡量MIH對模板蛋白質或其類似物特異性識別能力.

在25℃下，將50 mg凝膠干片在磷酸緩沖溶液（0.01 mol／L，pH＝7.0）中溶脹平衡，然后將凝膠片轉移至1.0 mg／mL BSA的磷酸緩沖溶液中進行吸附，通過紫外?可見分光光度法檢測凝膠片在不同吸附時間內對BSA的吸附量.

在25℃下，將50 mg凝膠干片在磷酸緩沖溶液（0.01 mol／L，pH＝7.0）中溶脹平衡，然后將水凝膠轉移到濃度為1.0 mg／mL蛋白質溶液中吸附3 h；收集吸附后的蛋白質溶液，用紫外?可見分光光度法進行檢測.選擇性因子（β）通過β＝IFtemp／IFana計算，其中IFtemp和IFana分別是MIH對模板蛋白質和其類似物的IF值.

在25℃下，將50 mg凝膠干片在磷酸緩沖溶液（0.01 mol／L，pH＝7.0）中溶脹平衡，然后將水凝膠轉移到含有1.0 mg／mL BSA，OVA和Lyz蛋白質混合溶液中吸附3 h；用0.5 mol／L的NaCl溶液對水凝膠進行洗脫，直到在紫外?可見光譜中觀察不到洗脫液中蛋白質的特征吸收峰；收集洗脫液（并用截留分子量為500的透析袋透析脫鹽；將透析液冷凍干燥，將產物溶于3mL磷酸緩沖液（0.01mol／L，pH＝7.0）中，采用SDS?PAGE對上述溶液進行檢測，其中聚丙烯酰胺的分離膠濃度為12.5%，濃縮膠的濃度為5%.

2 結果與討論

2.1 P（HEA?co?VIM）和P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）的表征

圖2給出P（HEA?co?VIM）和P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）的1H NMR譜圖.由圖2譜線a可見，δ7.6，7.2和6.9處的吸收峰分別對應咪唑環上氫原子的特征峰；δ4.9，4.0和3.5處的吸收峰為丙烯酸羥乙酯結構單元中羥基和亞甲基中氫原子的特征峰.P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）含有HEA，VIM和［AVIM］Cl結構單元，在圖2譜線b中，除了P（HEA?co?VIM）的特征峰外，在δ9.5和7.9處出現了離子化的咪唑環上氫原子的特征峰，并且在δ6.1和5.4處生成的新峰歸屬于碳碳雙鍵中氫原子的特征峰，可見，ACa通過與咪唑基團的烷基化反應，已經成功接枝到大分子單體中.

圖3給出P（HEA?co?VIM）和P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）的XPS譜圖.P（HEA?co?VIM）存在HEA和VIM 2種小分子單元.在圖3譜線a中，除了氫元素，P（HEA?co?VIM）中只含有C，O和N 3種

元素.而P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）中存在P（HEA?co?VIM）單元以外的第三種單體，即交聯劑單元［AVIM］Cl，因而在圖3譜線b中，除了含有C，O和N元素外，還含有Cl元素.P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）中C，O，N和Cl原子組成含量為68.31%，23.71%，6.14%和1.84%，可以推斷出，P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）中HEA，VIM和［AVIM］Cl結構單元的質量比為65.4∶7.5∶27.1.

Fig.21H NMR spectra of P（HEA?co?VIM）（a）and P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）（b）

Fig.3 XPS spectra of P（HEA?co?VIM）（a）and P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）（b）

圖4給出P（HEA?co?VIM）和P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）的GPC結果.其數均分子量（）分別為27761和28615，分子量分布較窄，PDI可達到1.1以下.

Fig.4 GPC analysis of P（HEA?co?VIM）（A）and P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）（B）

2.2 P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）及HEA，VIM，［AVIM］Cl對蛋白質結構的影響

CD光譜可用于測量和評估蛋白質二級結構的變化［8，9］.BSA在208和222 nm處的負峰可以提供α?螺旋結構的信息，特別是208 nm處的負峰，對外界環境變化的影響更為敏感.圖5（A）給出25℃時BSA與小分子單體（即HEA，VIM和［AVIM］Cl）相互作用后的CD譜.由圖5（A）可見，當小分子單體與BSA的質量比為1∶1時，BSA的2個特征負峰發生了不同程度的改變，208 nm處的變化更加明顯，通過神經網絡算法（CDNN，由應用光物理公司提供）可得，其α?螺旋結構含量從天然結構的60%下降到14%.繼續增加小分子單體的含量，小分子單體對蛋白質二級結構的破壞愈加嚴重.由圖5（B）可見，當P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）和BSA相互作用后，BSA在208和222 nm處的特征峰能夠保持相對完好，當P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）與BSA的質量比低于2∶1時，BSA的α?螺旋結構保持在58%以上，說明蛋白質的二級結構幾乎未發生任何改變，證明P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）對BSA具有十分明顯的穩定效果.

Fig.5 Effects ofm icromolecular monomers（A）and P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）（B）on the secondary structure of BSA

高濃度的P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）依然能夠對蛋白質的二級結構產生一定破壞作用，這可能是因為在低濃度下P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）自身的物理纏結效應較低，可較為自由地與蛋白質表面的官能團（如羧基、氨基）作用，因而貼合在蛋白質表面［Scheme 2（A），（B）］.當P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）在溶液中濃度較高時，P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）分子有較大幾率進行相互纏結［Scheme 2（C），（D）］，使其剛性大大增強，當蛋白質表面官能團與P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）纏結體具有較強的相互作用時，這種較強的作用分別延伸至P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）纏結體內部（物理交聯點）和蛋白質內部（維持蛋白質結構穩定的氫鍵作用），當纏結作用足夠大時，維持蛋白質結構穩定的氫鍵被破壞，因而構象發生改變［Scheme 2（D），（E）］.這種現象類似于固體界面對蛋白質吸附后導致蛋白質結構改變的行為［10］.

Schem e 2 Influence of different concentrations ofmacromolecular chain on the conformation of protein

為了進一步研究P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）和HEA，VIM及［AVIM］Cl對蛋白質結構的影響，本文采用同步熒光光譜研究其對蛋白質內部微環境的影響［11］.同步熒光光譜是一種敏感的檢測手段，用于研究發色基團周圍局部微環境的變化.這種光譜是通過同時掃描激發和發射波長來獲得，當激發和發射波長差（Δλ）恒定為15 nm或60 nm時，同步熒光光譜能分別獲得關于蛋白質內部酪氨酸殘基或色氨酸殘基的信息［12，13］.另外發射峰的偏移與發色基團周圍微環境變化有關，一般來說，峰的紅移代表周圍微環境極性增強，而藍移說明發色基團周圍微環境變得更加疏水.

由圖6（A）可見，當小分子單體與BSA相互作用后，BSA的酪氨酸殘基的熒光強度下降，并伴隨著發射峰的紅移，說明在加入小分子單體后，酪氨酸殘基周圍的極性變大.在圖6（C）中，BSA色氨酸

殘基的熒光強度也隨著小分子含量的增加而下降，發射峰也發生了明顯的紅移.當P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）與BSA相互作用后［圖6（B）和（D）］，發射光譜中的特征峰僅出現熒光猝滅，而峰的位置基本不發生改變.研究結果表明，小分子單體可以容易地滲透到蛋白質內部，因而能夠改變蛋白質內部微環境；而大分子單體可能更傾向于與蛋白質表面官能團進行作用，并且較大的分子體積使其難以擴散到蛋白質內部，破壞蛋白質的內部結構.

Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of BSA influenced by m icromolecular monomers（A，C）or macromolecular chains（B，D）

2.3 印跡水凝膠的形貌表征

圖7給出MIH?C?BSA，MIH?M?BSA，NIH?C?BSA和NIH?M?BSA的SEM照片.由圖7可見，印跡和非印跡水凝膠的表面形貌均為不規則的通孔結構，孔徑為20～50μm，這種大孔結構能夠有效增強蛋白質的傳質行為［14，15］，因而促進水凝膠的洗脫和吸附過程.

Fig.7 SEM images of M IH?C?BSA（A），M IH?M?BSA（B），NIH?C?BSA（C）and NIH?M?BSA（D）

2.4 印跡水凝膠的吸附動力學

圖8給出MIH?C?BSA，MIH?M?BSA，NIH?C?BSA和NIH?M?BSA的吸附動力學結果.由圖8可見，在1.0 mg／mL的BSA溶液中，MIH?C?BSA和MIH?M?BSA的吸附速率在120 min內遠遠高于NIH?C?BSA和NIH?M?BSA，說明在MIH?C?BSA中存在著BSA形狀的印跡孔穴，使MIH?C?BSA對BSA具有更強的吸附作用.研究發現，MIH?C?BSA吸附速率要高于MIH?M?BSA的吸附速率，說明MIH?C?BSA內部作用位點對BSA作用力更強，這可能是由于MIH?C?BSA在印跡過程中BSA的結構和構象保持完整，因而存在更為精確的印跡孔穴.所有水凝膠在180 min左右都可以到達吸附平衡，這是由于所制備

水凝膠的通孔形貌決定了蛋白質在其中有效且快速的傳質，加速了蛋白質的吸附平衡過程；另一方面，在組成水凝膠的結構中，存在對蛋白質具有較強作用的離子化咪唑基團，這種基團會加速對蛋白質吸附平衡過程［16，17］.

Fig.8 AdsorptiondynamiccurvesofMIH?C?BSA（a），NIH?C?BSA（b），MIH?M?BSA（c）andNIH?M?BSA（d）forBSA，respectively

Fig.9 AdsorptionisothermofMIH?C?BSA（a），NIH?C?BSA（b），MIH?M?BSA（c）andNIH?M?BSA（d）forBSA，respectively

2.5 印跡水凝膠的吸附等溫特性

圖9給出MIH?C?BSA，MIH?M?BSA，NIH?C?BSA和NIH?M?BSA的吸附等溫線.由圖9可見，所有的印跡水凝膠和非印跡水凝膠的平衡吸附量都隨著BSA初始濃度的增大而增大.同時還可以發現，MIH?C?BSA和MIH?M?BSA的平衡吸附量都高于NIH?C?BSA和NIH?M?BSA，說明在印跡水凝膠中存在印跡孔穴［18，19］.可以發現，MIH?C?BSA的平衡吸附量及識別效果均優于MIH?M?BSA，說明MIH?C?BSA內部的印跡孔穴數目更多，印跡孔穴的形狀更加精確，因此具有對BSA更高的吸附量和更好的識別能力.

為了進一步研究上述印跡和非印跡水凝膠對BSA的親合作用（Km）及理論最大吸附量（Qm），本文采用Langmuir吸附模型對吸附等溫曲線進行擬合［20，21］，Langmuir吸附模型參考公式ce／Qe＝1／KmQm＋ce／Qm，擬合結果如表1所示.2種印跡水凝膠對BSA的Km與Qm均高于非印跡水凝膠，進一步證明BSA被印跡到水凝膠內部.另外，分析MIH?C?BSA的Qm和Km值分別為91.7mg／g和2.79mL／mg，都明顯高于MIH?M?BSA的Qm和Km值，說明由P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）制備的印跡水凝膠具有更加優異的吸附量和識別能力，與文獻［6，7］研究結果相符.

Table1 Theoreticalmaximumcapacity（Qm）andLangmuiradsorptionequilibriumconstant（Km）fromtheLangmuirmodel

2.6 印跡水凝膠的選擇性吸附

為了研究水凝膠對模板蛋白質的選擇性，將MIH?C?BSA，MIH?M?BSA，NIH?C?BSA和NIH?M?BSA分別用于蛋白質的選擇性吸附研究.OVA，Hb和Lyz分別選為參比蛋白質.由表2可見，MIH?M?BSA 對Lyz具有較好的選擇能力，分離因子β值達到2.38.而對與BSA分子體積和等電點相似的Hb和OVA只有相對較差的選擇性，其β值分別為1.53和1.79.說明雖然MIH?M?BSA中具有印跡孔穴，但由于在MIH?M?BSA的制備過程中BSA結構被破壞，因而在印跡水凝膠內部形成的印跡孔穴不具有精確識別模板蛋白的能力.與之相比，MIH?C?BSA除了對結構相差較大的Lyz具有優異的選擇性外，對Hb和OVA的β值分別達到4.52和3.86，說明制備印跡水凝膠的過程中，完整的蛋白質結構可以增強其印跡孔穴的準確性，因而能夠提高印跡聚合物的選擇和識別能力.

Table 2 Selective adsorption experiments for M IH and NIH

2.7 印跡水凝膠的競爭吸附

圖10為印跡和非印跡水凝膠對蛋白質混合溶液吸附結果的凝膠電泳圖.圖10中泳道2為蛋白質混合溶液，在14.4×103，45×103，66.2×103處分別對應Lyz，OVA和BSA.泳道3～6分別對應 MIH?C?BSA，MIH?M?BSA，NIH?C?BSA和NIH?M?BSA在三元混合蛋白質溶液中的吸附結果.與泳道4和6相比，泳道3和5在66.2×103處的條帶顏色更深，同時在14.4×103和45×103處的條帶顏色相對較淺，說明MIH?C?BSA和MIH?M?BSA可以在混合蛋白質溶液中選擇性吸附BSA.另外，與泳道5相比，泳道3在66.2×103處的條帶顏色更深，并且在14.4×103和45×103處的條帶顏色更淺，說明MIH?C?BSA比MIH?M?BSA對BSA具有更好的識別能力.因此上述研究結果再次證明，由于P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）對BSA的良好穩定效果，使得MIH?C?BSA能夠產生更加精準的印跡孔穴，提高了其對BSA的特異性識別作用，有利于其對BSA的高效分離.

Fig.10 SDS?PAGE analysis of competitive adsorption of M IH?C?BSA and M IH?M?BSA

3 結 論

本文以P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）作為唯一的功能單體和交聯劑，在水相中對BSA進行了印跡.CD光譜和同步熒光光譜研究證明，小分子單體可以較為容易的滲透到蛋白質內部，因而能夠破壞維持其結構穩定的氫鍵，使得蛋白質結構和構象發生改變；而P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）更傾向于與蛋白質表面官能團進行作用，因而能夠在印跡過程中對BSA具有良好的穩定效果.吸附等溫實驗結果表明，MIH?C?BSA比MIH?M?BSA具有更高的吸附量和印跡因子.選擇性和競爭性吸附結果也表明，MIH?C?BSA具有更好的選擇性和識別能力.因此，采用大分子單體來穩定印跡蛋白質的策略可以有效地克服印跡過程中蛋白質的結構易變而難以準確印跡的難題，提高了印跡聚合物對模板蛋白質的特異性識別能力，對蛋白質印跡技術的發展具有重要意義.

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Utilizing Macromolecular Chain as Functional Monomer and Crosslinker to Imprint BSA with Preserving the Structural Integrity of Tem plate?

QIAN Liwei1?，LIJi2，SONGWenqi2，HU Xiaoling2，GUAN Ping2

（1．College of Bioresources Chemical and Materials Engineering，Shaanxi University ofScience and Technology，Xi'an 710021，China；2．School ofNatural and Applied Science，Northwestern Polytechnical University，Xi'an 710072，China）

Protein imprinted hydrogels were prepared via redox initiated polymerization by utilizing bovine serum albumin（BSA）as a template and poly（hydroxyethylacrylate?vinylimidazole?［1?（allylacetate）?3?vinyl?imidazolium］chloride）［P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）］as the macromolecularly functionalmonomer and crosslinker.The analytical results of circular dichroism and synchronous fluorescence spectrum demonstrated that P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）could effectively maintain the structural stability of BSA，while the equivalent HEA，VIM and［AVIM］Cl denatured the template protein.The selective and competitive adsorp?tion experiments showed that the imprinted hydrogels made by P（HEA?co?VIM?co?［AVIM］Cl）obtained better selectivity and recognition ability compared with thosemade by HEA，VIM and［AVIM］Cl.Therefore，the above results suggested the significant advantage ofmaintaining the structural and conformational stability of template protein during the preparation of imprinted polymers.The strategy of usingmacromoleculemonomer to imprint protein could effectively overcome the difficulty ofmutability of protein，thereforewould promote the development and application of protein imprinting technology.

Molecularly imprinting technology；Protein imprinting；Stability of protein；Circular dichroism；Synchronous fluorescence spectrum

O632.16；O658.2

A

10.7503／cjcu20160437

（Ed.：W，Z）

?Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.21174111）and the Key projectsof National Natural Science Foundation of China（No.51433008）.

2016?06?17；

日期：2016?09?20.

國家自然科學基金（批準號：21174111）和國家自然科學基金重點項目（批準號：51433008）資助.

聯系人簡介：錢立偉，男，博士，講師，主要從事分子印跡技術研究.E?mail：qianliwei@mail.nwpu.edu.cn