分離自木霉菌Trichoderma sp.的新型化合物Trichoderol A及絕對構型的確定

許蘭蘭，趙齊齊，俞 和，2，王景晨，王慧君，楊 芹，朱華結，李 艷

（1.藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室，河北省藥物質量分析控制重點實驗室，河北大學藥學院，保定071002；2.機械工業分析儀器產品質量監督檢測中心，北京100095；3.中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室，昆明650204）

分離自木霉菌Trichoderma sp.的新型化合物Trichoderol A及絕對構型的確定

許蘭蘭1，趙齊齊1，俞 和1，2，王景晨1，王慧君1，楊 芹1，朱華結1，李 艷3

（1.藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室，河北省藥物質量分析控制重點實驗室，河北大學藥學院，保定071002；2.機械工業分析儀器產品質量監督檢測中心，北京100095；3.中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室，昆明650204）

采用經典柱色譜方法從土壤真菌木霉菌Trichoderma sp.中分離得到1個新的化合物，為長鏈不飽和醇類.運用核磁共振及質譜等手段確定了化合物的平面結構，再結合電子圓二色譜（ECD）、旋光（OR）及量子化學方法計算確定其絕對構型.結果表明，該新化合物為Trichoderol A（1）.活性測試結果顯示，該化合物對3株致病菌具有一定程度的抗菌活性（MIC＝25μmol／L）.

Trichoderma sp.；電子圓二色光譜；旋光；矩陣模型；抗菌活性

天然產物絕對構型的確定是一個重要的研究課題，很多天然產物因其不易結晶或收率甚微而無法用單晶X射線衍射（X?ray）以及Mosher反應等物理、化學方法確定其絕對構型［1～3］.電子圓二色光譜（ECD）有效地解決了這一問題［4］，而且隨著量子化學的發展，ECD計算結果的精度越來越高，已成為天然產物絕對構型確定的重要手段［5～9］.

前文［8］從土壤真菌Trichoderma sp.發酵物中分離提取出1個新化合物，本文在此基礎上改變發酵條件再次培養，又分離得到1個新的化合物Trichoderol A（1），該類化合物為長鏈不飽和醇類線型分子.利用電子圓二色光譜確定了線性分子化合物1的絕對構型.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

所用試劑均為市售分析純產品.菌株來自河北大學校園內的土壤篩選出的真菌，經由北京三博遠志技術有限責任公司鑒定為木霉菌（Trichoderma sp.），該菌株的編號為SF?2（見本文支持信息表S1），NCBI基因Bank號為KX462885.

MOS?450型圓二色光譜儀（ECD，法國Bio?Logic公司）；AA?55系列全自動旋光儀（英國Optical Activity公司）；AvanceⅢ600 MHz核磁共振儀（TMS為內標，德國Bruker公司）；Micromass Q?TOF ESI?MS型質譜儀（美國Waters公司）；Agilent Accurate?Mass?Q?TOF ESI?MS 6520型高分辨質譜儀（美國Agilent公司）；紫外分光光度計（北京恒通瑞利公司）；LC?20A循環半制備色譜儀（日本島津公司）；全波長酶標儀（美國Thermo公司）；正相柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司）；凝膠Sephadex LH?20（美國Pharmacia公司）；C18反相填料（日本YMC公司）；GF254薄層色譜用硅膠（煙臺化學工業研究所）.

1.2 實驗過程

1.2.1 真菌培養 人工海水配比：將 NaCl（24.5 g／L），Na2SO4（3.9 g／L），KCl（0.7 g／L），KBr

（0.1 g／L），SrCl2（0.02 g／L），MgSO4·6H2O（5.0 g／L），CaCl2·H2O（1.1 g／L），NaHCO3（0.2 g／L），H3BO3（0.02 g／L）及NaF（0.004 g／L）混合，用蒸餾水定容至1 L，pH＝7.5.

Ⅰ型培養基配比：將甘露醇（20 g／L），酵母膏（3 g／L），麥芽糖（20 g／L），味精（5 g／L），葡萄糖（10 g／L），蛋白胨（5 g／L）及土豆（200 g／L）熬成汁，用人工海水定容至1 L，調節pH＝6.0.將菌種在Ⅰ型培養基中培養，共發酵100 L，于28℃，120 r／min搖床恒溫培養21 d.

1.2.2 化合物的提取和分離 將發酵產物用布氏漏斗抽濾，并將菌絲體與發酵液分離.將發酵液減壓濃縮至10 L，然后用等體積的乙酸乙酯萃取多次至無色，菌絲體同樣用乙酸乙酯等體積提取并減壓濃縮，將兩者合并得到35.0 g浸膏.對所得浸膏進行硅膠柱層析：用80～100目硅膠拌樣，200～300目硅膠裝柱，以二氯甲烷／甲醇（體積比分別為100∶0，100∶1，80∶1，50∶1，30∶1，15∶1，10∶1，5∶1，1∶1 和0∶1）溶液為流動相進行梯度洗脫，共得8個組分Fr.1～Fr.8.組分Fr.5依次通過Sephadex?LH?20（甲醇）、硅膠柱［V（二氯甲烷）∶V（甲醇）＝30∶1］、ODS柱［V（甲醇）∶V（水）＝4∶1］及高效液相色譜［V（甲醇）∶V（水）＝4∶1］分離，得到化合物1（12.0 mg）.

1.2.3 腫瘤細胞毒活性測試 采用MTT法［10］對化合物1進行腫瘤細胞毒活性檢測.所測試的5種腫瘤細胞分別為白血病細胞（HL?60）、肝癌細胞（SMMC?7721）、肺癌細胞（A?549）、乳腺癌細胞（MCF?7）和結腸癌細胞（SW480），以順鉑（MW 300）和紫杉醇（Taxol）作為陽性對照.

1.2.4 抗菌活性測試 采用96孔板2倍稀釋法［11］對化合物1進行了抗菌活性測試，3株測試菌株分別為惡臭假單孢桿菌（Pseudomonas putida）、巴西諾卡菌（Nocardia brasiliensis）和嗜根庫克菌（Kocuria rhizophila），以環丙沙星作為陽性對照.測定最小抑菌濃度MIC（μmol／L）.

2 結果與討論

2.1 化合物結構解析

Fig.1 Structure of com pound 1 and key HMBC and COSY of compound 1

化合物1的絕對構型通過比較圓二色光譜（ECD）實驗值與計算值來確定.該分子存在2個手性中心，那么理論上的絕對構型可能有4種，所以只需運用量子化學理論［12～17］計算其中2種構型（2組對

應異構體分別取其中1種）并對比實驗譜圖，便可確定化合物1的絕對構型.首先，利用軟件通過分子動力學力場MMFF94S方法［18］對分子（7R，8S）?1和（7S，8S）?1進行構象搜索，分別得到68和94個能量最低構象（ΔE＝0～10.224 kJ／mol），對2組構象分別在B3LYP／6?311＋G（d）基組［19］水平上進行優化計算，對優化后的能量在0～3.0 kJ／mol的29個構象［（7R，8S）?1構象19個，（7S，8S）?1構象10個］在氣相條件下用B3LYP／6?311＋＋G（2d，p）基組［19］分別進行ECD及OR計算［20］，OR計算結果分別為＋198.81和＋103.05，與實測值相符，說明另外2種構型與實測值相反，結果為這2種構型之一.再運用玻爾茲曼加合來擬合ECD譜圖，通過比對實驗ECD譜與計算ECD譜（圖2）發現，化合物構型為（7R，8S）?1與實驗更吻合；同時對比碳譜實驗值與計算值（表2），結果顯示這2種構型相似度區別不大，但13C NMR譜結果不能作為有效證據；再利用矩陣模型［3，5，21］用于計算C8的絕對構型.在此類結構中，由于對旋光值正負號起決定作用的是C8，因此使用矩陣計算了C8的特征值.其結果是在其構型為S

時，其det（D）值（矩陣中行列式的特征值即旋光值）為＋8.47.由于該化合物的實測旋光值為＋25，因此，其C8的絕對構型應該為S構型，這與ECD的結論一致.結合OR，ECD與矩陣模型數據分析表明，化合物1的絕對構型為（7R，8S）．化合物1的核磁共振譜、質譜圖見圖S1～S7（見本文支持信息），其計算ECD數據和實測ECD數據見表S2（見本文支持信息）.

Table 11H NMR，13C NMR and HMBC datas of com pound 1

Fig.2 Com parison of predicted ECD with experimental ECD for（＋）?1

Table 2 Calculated13C NMR data for（7R，8S）?1 and（7S，8S）?1

2.2 腫瘤細胞毒活性

化合物1的抗腫瘤細胞毒活性檢測結果如表3所示，可見，其未表現出明顯的腫瘤生長抑制活性.

Table 3 Antitumor activities of com pound 1

2.3 抗菌活性

測定了化合物1分別對惡臭假單孢桿菌（P．putida）、巴西諾卡菌（N．brasiliensis）和嗜根庫克菌（K．rhizophila）的活性.測試結果表明，化合物1對3株致病菌均有一定的抗菌活性，MIC值均為25 μmol／L，而陽性對照藥環丙沙星對3株致病菌的MIC值分別為0.625，0.313和0.625μmol／L.

3 結 論

從木霉菌Trichoderma sp.中分離到1個新的長鏈不飽和醇類化合物，通過ECD，OR實驗值與量子計算結果對比，最終確定Trichoderol A（1）的絕對構型為（7R，8S），說明量子化學計算在鏈狀分子絕對構型上具有一定的應用價值.化合物1的生物活性測試結果表明，其對5種腫瘤細胞未表現出明顯的腫瘤生長抑制活性（均為IC50＞40μmol／L），對3株致病菌均有一定的抗菌活性（MIC＝25μmol／L）.

支持信息見http：／／www.cjcu.jlu.edu.cn／CN／10.7503／cjcu20160499.

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Absolute Configuration Determ ination of One New Compound Trichoderol A from Trichoderma sp.Fungus?

XU Lanlan1，ZHAO Qiqi1，YU He1，2，WANG Jingchen1，WANG Huijun1，YANG Qin1，ZHU Huajie1?，LIYan3

（1．Key Laboratory ofMedicinal Chemistry and Molecular Diagnosis，Ministry ofEducation，Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Control ofHebei Province，College of Pharmaceutical Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2．Machinery Industry Analytical Industry Quality Supervision and Testing Centre，Beijing 100095，China；3．State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China，Kunming Institute ofBotany，Kunming 650204，China）

One new compound，trichoderol A（1），was isolated from cultures of the fungus Trichoderma sp. The structure of compound 1 was established bymeans of NMR and mass spectrometry.The absolute configura?tion（AC）was determined by means of comparing experimental electronic circular dichroism（ECD）and optical rotation（OR）of compound 1 with the calculated ECD and OR data of compound 1 using quantum methods，also usingmatrix model.Compound 1 was evaluated for antibacterial activities against three species of pathogenic bacteria，and the results showed that compound 1 had weak antibacterial activities（MIC＝25μmol／L）.

Trichoderma sp.；Electronic circular dichroism；Optical rotation；Matrix；Antibacterial activity

O629.9

A

10.7503／cjcu20160499

（Ed.：P，H，Y，K）

?Supported by the 2012 Giant Project of Hebei Province，China，the Science and Technology Support Project of Baoding，China（No. 15ZN020），the Scientific Research Foundation of Hebei Educational Committee，China（No.QN2016177）and the National Natural Science Foun?dation of China（No.41606174）.

2016?07?13.

日期：2016?09?26.

2012河北省巨人計劃、保定市科技支撐項目（批準號：15ZN020）、河北省教育廳資助科研項目（批準號：QN2016177）和國家自然科學基金（批準號：41606174）資助.

聯系人簡介：朱華結，男，博士，教授，博士導師，主要從事手性藥物化學研究.E?mail：jackzhu2002@sina.com