高糖環境下人骨髓間充質干細胞復合兔脫細胞真皮支架體外成骨能力檢測

張彧婷 孫 權 沙 峰 孫石柱 姚立杰 李靜平 沈 雷

齊齊哈爾醫學院解剖學教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

高糖環境下人骨髓間充質干細胞復合兔脫細胞真皮支架體外成骨能力檢測

張彧婷 孫 權 沙 峰 孫石柱 姚立杰 李靜平 沈 雷

齊齊哈爾醫學院解剖學教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

目的探討脫細胞真皮支架在高糖環境下對骨髓間充質干細胞（hBMSC）的保護作用，以及促進hBMSC向成骨細胞分化的能力。方法建立脫細胞真皮基質和含300mmol/L葡萄糖的細胞高糖模型，在高糖環境下，培養hBMSC為高糖對照組，在高糖條件下，hBMSC種植在脫細胞真皮基質上為基質實驗組，正常條件下培養的hBMSC為正常對照組，每組均進行成骨細胞誘導實驗。利用MTT實驗檢測hBMSC的增殖情況；利用骨形成蛋白-1（BMP-1）免疫熒光染色檢測hBMSC成骨細胞分化情況，ELISA實驗檢測各組hBMSC的BMP-1、堿性磷酸酶（ALP）的含量。結果與高糖對照組比較，基質實驗組hBMSC的細胞增殖光密度（OD值）升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；hBMSC在脫細胞真皮基質的生長狀態良好，基質實驗組BMP-1染色陽性的細胞數目明顯高于高糖對照組（P＜0.01）；基質實驗組BMP-1、ALP等蛋白的含量明顯增高（P＜0.01）。結論高糖環境下，脫細胞真皮基質有利于促進hBMSC分化為成骨細胞。

高糖；骨髓間充質干細胞；脫細胞真皮基質；成骨細胞

糖尿病是一種以高血糖為典型表現的復雜性全身疾病，高血糖狀態常導致血管、神經發生嚴重的病理改變［1］。Palmer BF認為：糖尿病及其并發癥已經成為影響我國等國家發展的重要影響因素［2］，人口老齡化和糖尿病患病人數的增多常導致糖尿病患者骨質疏松，骨折不易愈合等嚴重問題［3］，加重患者家庭及社會經濟負擔［4］。如何改善糖尿病骨質狀況，加速糖尿病性骨損傷的修復是迫切需要解決的問題。

脫細胞皮膚基質間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）由于具有來源廣泛、低免疫性、多分化等優勢，為逆轉糖尿病性組織缺氧和促進組織修復帶來了希望，是細胞治療和骨組織工程技術首選的種子細胞［5］。皮膚組織的再生能力非常強，脫細胞真皮細胞外基質具有復雜的三維結構［6］，是具有廣泛應用前景的生物組織支架材料，對支持移植細胞生長、促進組織修復具有關鍵效果［6］。但是高糖狀態下，MSC在脫細胞真皮基質的成骨分化尚鮮見報道。本研究擬揭示高糖環境下，MSC在脫細胞真皮基質的生長和成骨分化情況，為MSC組織工程技術促進骨組織新生，治療高糖缺氧性骨組織損傷奠定研究基礎。

1 料與方法

1.1 細胞來源

GFP標記的人骨髓間充質干細胞（hBMSC）購于廣州賽業生物公司。

1.2 主要試劑和實驗儀器

體重2～3 kg雄性新西蘭白兔購自齊齊哈爾醫學院動物實驗中心［動物合格證號：SYXK（黑）20140022］，胎牛血清（FBS）、α-MEM培養基、青鏈霉素和L-谷氨酰胺均購于廣州賽業生物公司，地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、VEGF、噻唑藍（MTT）和葡萄糖等均購于美國Sigma公司，兔抗人BMP-1抗體和TRITC標記羊抗兔IgG購自美國Santa cruz公司，人骨形成蛋白-1（BMP-1）、堿性磷酸酶（ALP）的ELISA試劑盒購于美國R&D公司。Emax酶標儀為美國Molecular Devices公司產品，F-7000熒光分光光度計為日立公司產品，BX50型顯微鏡和SU1510型掃描電子顯微鏡分別為日本OLYMPUS、日立公司的產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 脫細胞真皮的制備8只體重2～3 kg雄性新西蘭白兔，按照30 mg/kg耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉，常規備皮、消毒，切取背部6 cm×6 cm全層皮膚，清理周圍組織后，首先加入0.9%氯化鈉溶液，在37℃搖床孵育12 h，去除表皮層［6］；然后置于0.125%胰蛋白酶溶液中，37℃，消化24 h，依次經過0.1%、0.5%十二烷基磺酸鈉（SDS）震蕩洗滌12 h，60Co消毒處理密封，-80℃保存。掃描電鏡觀察樣品結構［7-8］。

1.3.2 細胞培養和實驗分組含10%FBS的α-MEM培養基培養hBMSC，37℃、5%CO2培養者為正常對照組；若α-MEM培養基中含300mmol/L葡萄糖，則為高糖培養基。在細胞高糖模型下，未進行任何刺激的hBMSC為高糖對照組；將hBMSC種植在脫細胞真皮基質上進行培養則為基質實驗組；每組細胞均進行成骨誘導分化。成骨分化培養基為：α-MEM培養基中若含10%FBS、1×10-7mol/L地塞米松、50 mg/L抗壞血酸、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉。

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖情況按實驗分組，或在96孔板底放置脫細胞真皮基質，每組均添加1×104hBMSC后，在正常條件下培養24 h。每孔加入150μL含 0.1%FBS的正常或高糖α-MEM培養基，37℃、5%CO2條件下培養12 h；每孔加入20μL的5%MTT孵育4 h，然后添加100μL二甲基亞砜，492 nm波長測定每個樣品吸光度（OD值）。

1.3.4 免疫熒光染色各組分化誘導的hBMSC，DAPI進行細胞核標記，4%多聚甲醛固定，4℃條件下，用兔抗人BMP-1抗體（1：200）孵育12 h后，添加山羊抗兔IgG（1：150），DAKO水溶性封片液進行封片。

1.3.5 人BMP-1、ALP蛋白的檢測按照人BMP-1、ALP蛋白的ELISA試劑盒說明，裂解各組細胞，提取各組細胞裂解液，ELISA實驗檢測人BMP-1、ALP蛋白的表達。

1.4 統計學方法

所有實驗均重復3次，實驗數據采用SPSS 18.0軟件進行統計，結果以均數±標準差（x±s）表示，并進行方差分析或t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 果

2.1 hBMSC的增殖情況

正常對照組、高糖對照組和基質實驗組hBMSC增殖的OD值進行方差分析，發現各組hBMSC增殖的OD值并不相等（F=247.35，P=0.0001）。與正常對照組OD值（1.453±0.164）比較，高糖對照組hBMSC的OD值（0.618±0.110）明顯降低，二者比較差異有統計學意義（P＜0.01）；與高糖對照組比較，基質實驗組hBMSC的細胞增殖OD值（1.294±0.135）升高比較明顯，二者比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 脫細胞真皮基質結構

掃描電鏡觀察發現，未脫細胞的皮膚比較致密，見圖1A；脫細胞真皮基質幾乎不含細胞，纖維組織比較豐富，空隙較大，見圖1B。

圖1 掃描電鏡觀察正常皮膚或脫細胞真皮基質的形態

2.3 各組hBMSC的BMP-1染色和掃描電鏡觀察

與高糖對照組比較，基質實驗組BMP-1染色陽性的細胞明顯增多，差異有統計學意義（Q=9.535，P＜0.01），見圖2A、2B。掃描電鏡觀察發現，hBMSC突起較多，與脫細胞真皮基質黏附在一起，生長狀態良好，見圖2C。

圖2 各組hBMSC在脫細胞真皮基質的生長和成骨分化

2.4 ALP、BMP-1蛋白的檢測

與未脫細胞皮膚比較，脫細胞真皮基質的ALP蛋白含量降低（P＜0.05）；相對于未脫細胞皮膚，脫細胞真皮基質組的BMP-1蛋白含量降低（P＜0.05），見表1。與高糖對照組比較，基質實驗組的ALP蛋白含量明顯增高（P＜0.01）；相對于高糖對照組，基質實驗組的BMP-1蛋白含量明顯增高（P＜0.01），見表2。

表1 正常條件下未脫細胞皮膚與脫細胞真皮基質的ALP、BMP-1含量（μg/mL，n=24）

表1 正常條件下未脫細胞皮膚與脫細胞真皮基質的ALP、BMP-1含量（μg/mL，n=24）

注：ALP：堿性磷酸酶；BMP-12：骨形成蛋白-1

組別ALP BMP-1未脫細胞皮膚脫細胞真皮基質t值P值11.352±0.841 1.386±0.538 48.894 0.037 17.121±0.915 2.823±0.393 70.339 0.021

表2 高糖條件下對照組與基質實驗組的ALP、BMP-1含量（μg/mL，，n=24）

表2 高糖條件下對照組與基質實驗組的ALP、BMP-1含量（μg/mL，，n=24）

注：ALP：堿性磷酸酶；BMP-12：骨形成蛋白-1

組別ALP BMP-1對照組基質實驗組t值P值4.539±0.221 8.947±0.625 118.712 0.00001 5.204±0.180 10.468±0.853 57.851 0.0001

3 論

隨著世界經濟、交通高速發展，全球骨損傷的發病率逐年增加；外傷、感染或腫瘤切除導致的骨組織損傷、骨延遲愈合或不連接問題是世界性骨科難題。糖尿病及其并發癥已經成為困擾人們的重要疾病，由于糖尿病的高血糖狀態常常導致多種離子、多糖成分代謝紊亂，進而發生糖尿病性骨質疏松等骨疾病［9］，嚴重影響著患病人群的健康和生命質量。

骨組織除了含有較多血管、神經纖維外，還含有大量骨細胞，對骨的再生修復具有重要意義。雖然利用MSC分化為骨細胞對促進骨組織損傷具有重要意義［10］，但是，如果能夠在三維環境下激發間充質干細胞的成骨分化活性，將對利用組織工程技術促進糖尿病性骨損傷修復具有重要意義。皮膚是人體最大的器官，再生能力非常強，如果利用宿主皮膚構建組織工程材料將降低患者排斥反應，皮膚中含有的3D結構和有效的活性因子將有效促進種子細胞分化和生長，對治療糖尿病骨病等具有重要意義。研究發現，存在于骨髓、脂肪等多種組織的MSC，具有多分化性能、易適應局部微環境生存等特咖［11］。在缺血性心臟病、糖尿病足皮膚潰瘍等許多由于缺氧引起的疾病治療中，利用MSC細胞治療技術或MSC組織工程技術具有喜人的治療效果和廣泛的應用［12］，并認為MSC的多分化特性更適用于糖尿病等多種組織損傷的病例［12］。也有研究發現，高糖缺氧環境會導致組織產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［13］，ROS粒子比較微小，由于存在未配對的自由電子，因此ROS十分活躍，呈現一種不穩定自由基狀態，往往導致細胞膜脂質、蛋白質等發生變性，造成MSC、血管內皮細胞等細胞器損傷，細胞生物活性降低，造成組織損傷等［14］。因此，抗高糖損傷一直是移植MSC技術確保移植細胞正常生長和分化的關鍵問題。如果利用自體生物組織材料既可以避免生物排斥反應，又可以促進MSC生長，達到修復骨組織損傷的目的，將較好地解決高糖環境下，移植的MSC活性降低等問題。相對于腸黏膜等部位組織，皮膚是人體最大的淺表器官，取材方便，再生能力強，符合自體生物組織材料的篩選條件［15］。

皮膚的細胞外基質主要由膠原蛋白、纖維蛋白、整合素等多糖或蛋白質構成復雜的三維結構，并具有良好的孔隙率和豐富的細胞活性因子等條件，可以更好地利于體內細胞的生長［16］，如果良好模擬細胞的體內生長基質，將對細胞的生長具有積極作用。近年來發現，MSC、內皮祖細胞（EPC）在靜電紡絲制作的三維納米生物材料上尚能正常生長，并對糖尿病足具有促進愈合的作用［17-18］，這些成果提示，構建脫細胞的皮膚細胞外基質會具有較好的三維立體結構，皮膚基質中的VEGF、EGF等多種細胞活性因子能夠促進種植的MSC生長，對維持MSC功能、促進MSC分化具有重要影響。在本實驗中，掃描電鏡下也可以觀察到脫細胞真皮基質的纖維組織間隙較大，纖維縱橫交錯，細胞結構分成非常少，說明皮膚脫細胞比較徹底，排除了皮膚細胞對實驗的干擾。說明利用梯度SDS法脫細胞簡單可行。相對于高糖對照組，基質實驗組MSC增殖的OD值明顯升高，MSC在脫細胞真皮基質的生長狀態良好，說明脫細胞真皮基質的三維結構更好地模擬了體內細胞生長環境［19］，適合MSC在高糖環境的生長，此外，還可能是由于皮膚基質含有一定量的VEGF、EGF等細胞因子，這些因子對促進細胞生長和黏附于三維介質具有積極作用［20］，研究也發現，基質實驗組的MSC分化為成果細胞能力明顯強于高糖對照組，這進一步說明脫細胞真皮基質的確含有成骨誘導因子，可以促進MSC分化為成骨細胞。本研究利用BMP-1染色的手段，也發現基質實驗組BMP-1染色的陽性細胞數明顯高于高糖對照組，說明脫細胞真皮機制包含的VEGF等因子［15］積極促進了MSC在脫細胞真皮基質向成骨細胞分化。

綜上所述，利用脫細胞真皮基質將對保護MSC抗高糖缺氧損傷，為促進MSC分化為成骨細胞帶來機遇。由于皮膚基質中含有大量成骨因子，如果將含MSC的脫細胞真皮基質移植到糖尿病組織損傷區域，將對加快修復糖尿病性組織疾病具有重要意義。下一步擬將血管活性因子、趨化因子等轉染到MSC內，構建含修飾后MSC的人工皮膚，觀察MSC組織工程治療糖尿病骨損傷，動員血管內皮細胞等宿主細胞歸巢，加速組織損傷修復的作用和機制，為移植MSC的臨床應用和細胞歸巢的研究提供基礎研究數據。

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Detection of human bonemarrow mesenchym al stem cells integrate rabbit acellular dermal matrix stenting of in vitro osteogenesis ability in high glucose environment

ZHANG Yuting SUN Quan SHA Feng SUN Shizhu YAO Lijie LIJingping SHEN Lei
Department of Anatomy，QiqiharMedical School，Heilongjiang Province，Qiqihar 161006，China

Objective To investigate the protective effect of human bonemarrowmesenchymal stem cells（hBMSC）with the acellular dermalmatrix stenting in the high glucose environment，and the differentiation ability with the promotion form human bone marrow mesenchymal stem cells to osteoblasts.Methods Acellular dermal matrix and the high glucose model of containing 300 mmol/L glucose were established.With the high glucose environment，hBMSC was cultured to be the controlgroup.With the high glucose condition，hBMSC was planted to be the acellular dermalmatrix experimental group.With the normal condition，hBMSC was planted to be the normal control group.All groups had the osteoblasts induction experiment，the proliferation of hBMSC was detected by using MTT.the osteoblasts differentiation of hBMSC was detected by using fluorescence staining，and the content of BMP-1 and ALP in the experiment groups was detected by using ELISA.Results Compared with the high glucose control group，cell proliferation and matrix optical density（OD）of the hBMSCmatrix experiment group was increased，with significant statistic difference（P＜0.01）；hBMSC was in good condition in the acellular dermalmatrix.The number of BMP-1 positive cells in the culture group was significantly higher than that in the high glucose group（P＜0.01）；The contents of BMP-1，ALP proteins were significantly increased（P＜0.01）.Conclusion In the high glucose environment，the acellular dermalmatrix has the significantpromotion of differentiation from hBMSC to osteoblasts.

High glucose；Bonemarrow mesenchymal stem cells；Acellular dermalmatrix；Osteoblast

R318.06

A

1673-7210（2016）05（c）-0021-04

2016-01-29本文編輯：趙魯楓）

黑龍江省教育廳面上項目（12541901）。

張彧婷（1978-），女，碩士，主要從事骨組織修復研究。

沈雷（1975-），男，碩士，副教授，碩士生導師，主要從事干細胞組織工程與再生醫學研究。