N-乙酰半胱氨酸對動脈粥樣硬化大鼠血脂及氧化應激的影響

嚴俊 史婷婷 莊讓笑 周曉霞 蔡兆斌

1.浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州西溪醫(yī)院急診科，浙江杭州310023；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州西溪醫(yī)院制劑室，浙江杭州310023；3.浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州西溪醫(yī)院，浙江杭州310023

N-乙酰半胱氨酸對動脈粥樣硬化大鼠血脂及氧化應激的影響

嚴俊1史婷婷2莊讓笑2周曉霞1蔡兆斌3▲

1.浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州西溪醫(yī)院急診科，浙江杭州310023；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州西溪醫(yī)院制劑室，浙江杭州310023；3.浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州西溪醫(yī)院，浙江杭州310023

目的探討N-乙酰半胱氨酸（NAC）對動脈粥樣硬化大鼠血脂及氧化應激的影響。方法60只SD大鼠隨機分為正常對照組（10只）和造模組（50只）。造模組大鼠通過高脂飲食聯(lián)合維生素D3建立動脈粥樣硬化模型，然后隨機分為模型組、辛伐他汀對照組、NAC低劑量組、NAC中劑量組和NAC高劑量組，每組各10只。模型組喂以高脂飼料，辛伐他汀對照組每天灌胃辛伐他汀5 mg/（kg·d），NAC低、中、高劑量組每天灌胃NAC 100、200、300mg/（kg·d）。藥物干預8周后，觀察大鼠胸腹主動脈病理變化以及血脂［總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、氧化型低密度脂蛋白膽固醇（ox-LDL）］、血氧化應激指標［血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）］的含量。結果與正常對照組相比，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL升高，血氧化應激指標SOD、GSH-Px降低，MDA增高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，NAC中、高劑量組和辛伐他汀對照組對照大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL降低，NAC低劑量組TC、LDL-C、ox-LDL降低，NAC各組和辛伐他汀對照組大鼠血氧化應激指標SOD、GSH-Px升高，MDA降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。NAC各組與辛伐他汀對照組相比，NAC低劑量組的LDL-C、ox-LDL升高，NAC高劑量組的LDL-C、ox-LDL降低，NAC低劑量組的SOD、GSH-Px降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；余指標之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論NAC可能通過調(diào)節(jié)血脂、抗氧化應激等多條途徑發(fā)揮抗動脈粥樣硬化形成的作用。

N-乙酰半胱氨酸；動脈粥樣硬化；氧化應激

心腦血管疾病（cardiac-cerebral vascular disease，CCVD）已成為人類死亡的首要病因［1］。目前，我國CCVD患者已經(jīng)超過2.7億人，我國每年有近300萬人因心腦血管疾病死亡，占我國每年總死亡病因的51%。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病最重要的病理基礎，是引發(fā)心腦血管疾病最主要的危險因素［2］。AS的發(fā)病機制十分復雜，主要學說有脂質(zhì)浸潤學說、內(nèi)皮功能紊亂學說、損傷反應假說、氧化假說等，但都不能全面解釋AS的發(fā)生［3］。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）具有抗氧化、抗凋亡等作用［4］。本研究通過NAC對AS大鼠進行干預，觀察大鼠動脈病理變化及血脂、血氧化應激指標情況，探討NAC對AS大鼠血脂和氧化應激的影響。

1 料與方法

1.1 實驗動物

選用SD大鼠60只，清潔級，由浙江省醫(yī)學科學院提供，動物合格證編號：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 高脂飼料

配方：81.39%基礎飼料，10%豬油，2%膽固醇，1%膽鹽，0.61%丙基硫氧嘧啶和5%蛋黃粉。高脂飼料在浙江省醫(yī)學科學院加工完成。

1.3 主要藥物、試劑及儀器

N-乙酰半胱氨酸：武漢武大弘元藥業(yè)，批號：20150512。辛伐他汀片：杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字：H19990367。維生素D3注射液：上海通用藥業(yè)，國藥準字：H31021404，規(guī)格：每支30萬U。試劑：氧化型低密度脂蛋白膽固醇（ox-LDL）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

日立7060全自動生化分析儀（日立公司，日本）、ZMN-7803切片包埋機（常州市華利電子有限責任公司）、恒溫水浴箱Model DK-8D（上海森信實驗儀器有限公司）、低溫高速離心機（Hettich公司，德國）、光學顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）。

1.4 動物分組及造模

60只SD大鼠適應性觀察1周，隨機分為正常對照組（10只）和造模組（50只）。正常對照組以普通飼料喂養(yǎng)。造模組連續(xù)3 d腹腔注射維生素D360萬U/kg，同時采用高脂飼料喂養(yǎng)。8周后，造模組隨機分為模型組、辛伐他汀對照組、NAC低劑量組、NAC中劑量組和NAC高劑量組，每組各10只。模型組給予高脂飼料，辛伐他汀對照組灌胃給予辛伐他汀5 mg/（kg·d），NAC低、中、高劑量組每天灌胃給予100、200、300mg/（kg·d）NAC，繼續(xù)飼養(yǎng)8周。飼養(yǎng)條件：實驗期間各組大鼠分籠喂養(yǎng)，自由進食，日光燈照明，明暗各12 h。

1.5 標本采集

末次給藥當晚禁食不禁水16 h，隨后以3%的戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉。解剖大鼠，腹主動脈采血，室溫放置2 h后3000 r/min離心10min，取上清液，放入-20℃冰箱保存待用。沿正中線剪開胸腹部皮膚分離并暴露胸腹主動脈，取出胸腹主動脈（從主動脈弓至髂總動脈分叉處），行HE染色觀察病理變化。

1.6 指標檢測

采用日立7060全自動生化分析儀檢測血總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量。采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）測定ox-LDL含量；采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，硫代巴比妥酸反應法測定血清MDA含量；用5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB）比色法測定GSHPx活性。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 果

2.1 各組大鼠主動脈病變程度

正常對照組大鼠肉眼觀主動脈壁光滑，HE染色下動脈壁內(nèi)膜薄而光滑，未見泡沫細胞，中層平滑肌層細胞核大小均勻，排列整齊，厚度正常，外層脂肪層薄，各層結構清晰完整。與正常對照組比較，模型組主動脈管腔變窄，HE染色下內(nèi)膜增厚，向管腔內(nèi)突起，出現(xiàn)泡沫細胞積聚，中層平滑肌細胞核大小不均，排列紊亂，細胞增生，外層脂肪層增厚，動脈壁三層結構紊亂。與模型組比較，NAC中、高劑量組和辛伐他汀對照組大鼠主動脈血管壁變薄，內(nèi)膜相對平滑，平滑肌細胞排列相對整齊，接近正常對照組；而NAC低劑量組的主動脈血管壁增厚，平滑肌細胞排列紊亂、增生，接近模型組。見圖1。

圖1 各組大鼠主動脈病變程度（HE染色，200×）

2.2 各組大鼠血脂水平比較

與正常對照組相比，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL水平均有不同程度的增高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，NAC中、高劑量組和辛伐他汀對照組血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL水平均有不同程度降低，NAC低劑量組TC、LDL-C、ox-LDL水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與辛伐他汀對照組相比，NAC低劑量組LDL-C、ox-LDL水平升高（P＜0.01），NAC高劑量組LDL-C、ox-LDL水平降低（P＜0.05）；其他指標各組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血脂水平比較（x±s）

2.3 各組大鼠氧化應激指標比較

與正常對照組相比，模型組大鼠血清MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，NAC低、中、高劑量組和辛伐他汀對照組大鼠血清MDA水平降低，SOD、 GSH-Px水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。與辛伐他汀對照組相比，NAC低劑量組SOD、GSH-Px水平明顯下降（P＜0.01）；其他指標各組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠氧化應激指標比較（x±s）

3 論

AS的發(fā)病機制十分復雜，脂質(zhì)沉積、炎性反應、內(nèi)皮損傷、氧化應激反應等多種病理環(huán)節(jié)共同參與其中。幾十年來，普遍認為脂質(zhì)是AS的元兇，血脂異常升高是AS的始動因素之一［5］。大多數(shù)AS模型的建立都是以高脂血癥為基礎，血脂水平的高低與AS的發(fā)生呈正相關［6］。周永剛等［7］采用高脂飼料聯(lián)合維生素D3喂養(yǎng)大鼠，8周后發(fā)現(xiàn)高脂組大鼠血脂水平（TC、TG、LDL）明顯增高，心臟、肝臟、主動脈等組織油紅O染色陽性，表明大量脂質(zhì)沉積，主動脈肉眼可見脂質(zhì)斑塊，油紅O染色大面積紅染。機體血脂水平升高，加速脂質(zhì)在血管壁的沉積，進一步侵襲破壞血管壁，形成脂質(zhì)條紋，是AS發(fā)生的基礎，尤其是LDL-C沉積在血管壁后發(fā)生氧化反應形成ox-LDL，對內(nèi)皮細胞、單核細胞等有很大的毒性和化學趨化作用。ox-LDL與內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等細胞膜上的凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體1（LOX-1）［8］相結合，可以損傷內(nèi)皮細胞，使細胞膜的通透性增加，從而使ox-LDL內(nèi)吞形成泡沫細胞，大量的泡沫細胞聚集在一起，使血管壁增厚，向外突出形成脂質(zhì)斑塊，導致AS的形成。因此，ox-LDL作為AS的獨立危險因素之一［9］，越來越引起大家的重視。本實驗中模型組大鼠血脂（TC、TG、LDL-C、ox-LDL）水平明顯增高，AS病理改變明顯；而各藥物組大鼠血脂水平下降，AS病理改變有所改善。

氧化應激反應在AS病程中發(fā)揮著重要作用［10］，是其獨立危險因素。氧化應激是指機體或細胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，導致活性氧族（reactive oxygen species，ROS）過量積聚，從而引起的一系列氧化損傷反應［11］。當血脂升高時，機體抗氧化能力降低，ROS產(chǎn)生過量，氧化應激反應增強。過量的ROS可以使LDL中的不飽和脂肪酸發(fā)生氧化修飾形成ox-LDL，ox-LDL則進一步形成泡沫細胞，加速AS的形成。另外，氧化應激還能誘導細胞凋亡，血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞凋亡在AS中發(fā)揮著重要作用。其中，血管內(nèi)皮細胞凋亡是AS發(fā)生的始動因素之一［12］。有實驗表明，LDL和ox-LDL能夠抑制高脂血癥中血管擴張因子一氧化氮（NO）的產(chǎn)生與內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表達，誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡，從而促進動脈粥樣硬化的形成［13］。

正常機體內(nèi)始終保持著氧化與抗氧化平衡。酶性抗氧化物質(zhì)主要包括SOD、過氧化氫酶（CAT）、GSHPx等。各種抗氧化物質(zhì)可以協(xié)同清除過量的ROS、氧自由基，從而減輕氧化應激對機體的損傷［14］。在這些抗氧化酶中，只有SOD能將超氧陰離子催化成相對穩(wěn)定的過氧化氫，它可以清除氧自由基，減輕組織的過氧化損傷［15］。MDA是機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化代謝的產(chǎn)物，可以直接反映機體脂質(zhì)過氧化反應的強度，間接反映細胞損傷的程度。MDA是一個重要的氧化應激標志物［16］。GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶，它能使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而減輕過氧化物對細胞的侵害，保持細胞膜的結構和功能完整。本實驗中，模型組ox-LDL、MDA含量提高，SOD、GSH-Px活性下降，說明機體氧化應激水平提高，而各藥物組上述指標改善，說明氧化應激水平改善。

NAC在臨床上多年來作為黏痰溶解藥，還具有抗過氧化損傷的作用。可能機制為NAC分子中有活性巰基（-SH），通過自身的-SH氧化還原參與氧化反應過程，具有干擾自由基生成、清除已生成的自由基、調(diào)整基因的表達和阻礙細胞信號轉導、抗細胞凋亡等作用［17］。另外，NAC進入細胞脫乙酰基后生成半胱氨酸，可以促進谷胱甘肽（GSH）的合成，提高組織內(nèi)GSH含量。GSH是體內(nèi)重要的非酶性抗氧化劑和自由基清除劑，在機體抗氧化應激反應中發(fā)揮著重要作用［18］。目前國內(nèi)已經(jīng)有很多實驗證實NAC對心臟、肝、腦、肺等組織有抗過氧化損傷的保護作用［19-20］。

本實驗通過NAC對AS大鼠的干預，血脂指標明顯下降，血氧化指標明顯改善，AS病變程度減輕。初步證明了NAC可以通過調(diào)血脂、抗氧化應激等途徑發(fā)揮抗AS的作用，值得進一步深入研究，為以后NAC的臨床開發(fā)應用提供基礎研究支持。

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Effectsof N-acetylcysteineon serum lipidsand oxidativestress in atherosclerosis rats

YAN Jun1SHITingting2ZHUANG Rangxiao2ZHOU Xiaoxia1CAIZhaobin3▲
1.Department of Emergency，Hangzhou Xixi Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Province，Hangzhou 310023，China；2.Department of Pharmaceutic Preparation，Xixi Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Province，Hangzhou 310023，China；3.Hangzhou Xixi Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Province，Hangzhou 310023，China

Ob jective To study the effects of N-acetylcysteine on blood lipids and oxidative stress in atherosclerosis rats.M ethods 60 SD rats were random ly divided into the normal control group（n=10）and themodel group（n=50）. Rats in themodel group were established atherosclerosismodel by high-fat diet combined with vitamin D3，then，they were random ly divided into the model group，Simvastatin group，NAC low dose group，NAC middle dose group and NAC high dose group，each group had 10 rats.Then rats in themodel group were fed with high fat diet，the Simvastatin control group were administered with Simvastatin 5 mg/（kg·d），NAC low，middle and high dose groups were administered NAC 100，200，300mg/（kg·d）.After 8 weeks of drug intervention，the pathological changes in thoraco-abdominal aorta of rats were observed，blood lipid［total cholesterol（TC），three acyl glycerin（TG），low density lipoprotein（LDLC），oxidized low density lipoprotein cholesterol（ox-LDL）］and blood oxidative stress index［serum superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px），malondialdehyde（MDA）］were detected.Results Compared with the normal control group，the levels of serum TC，TG，LDL-C，ox-LDL in themodel group increased，the levels of antioxidant indicators SOD and GSH-Px decreased，the level of MDA increased，with statistically significant differences（P＜0.01）. Compared with themodel group，the levels of serum TC，TG，LDL-C，ox-LDL in NAC middle and high dose groups and the Simvastatin group decreased，the levelsof serum TC，LDL-C，ox-LDL in NAC low dose group decreased，the levels of SOD and GSH-Px in all NAC groups and the Simvastatin group increased，the level of MDA decreased，with statistically significant differences（P＜0.05）. Compared with the Simvastatin group，the levels of LDL-C，ox-LDL in the NAC low dose group increased，the level of LDL-C，ox-LDL in the NAC high dose group decreased，the level of SOD，GSH-Px in the NAC low dose group decreased，with statistically significant differences（P＜0.05）.There were no significant differences between the remaining indicators（P＞0.05）.Conclusion NACmay play an anti-atherosclerotic role by adjusting blood lipid，resisting oxidative stress and so on.

N-acetylcysteine；Atherosclerosis；Oxidative stress

R363

A

1673-7210（2016）05（c）-0013-05

2016-02-20本文編輯：程銘）

浙江省杭州市科技發(fā)展計劃項目（20130633B09，20130733Q30）。

▲通訊作者