重癥監(jiān)護(hù)病房醫(yī)院感染耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因的研究與分析

陳　璐，李凌竹，冷應(yīng)蓉，查筑紅，程永素，黃　冰，羅光英，王　敏，江銀輝（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染管理科，貴州貴陽(yáng) 550004）

重癥監(jiān)護(hù)病房醫(yī)院感染耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因的研究與分析

陳璐，李凌竹，冷應(yīng)蓉，查筑紅，程永素，黃冰，羅光英，王敏，江銀輝（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染管理科，貴州貴陽(yáng) 550004）

目的：通過(guò)分析菌株耐藥性和耐藥基因檢出情況，了解我院醫(yī)院感染耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）的流行病學(xué)特點(diǎn)，并探討耐藥機(jī)制，為臨床合理選藥提供參考。方法：篩選重癥監(jiān)護(hù)病房醫(yī)院感染患者送檢標(biāo)本分離的CRAB，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)菌株是否攜帶OXA-23、TEM、SHV、VEB、CARB、DHA、VIM、IMP、PER、aac(3)-I、aac(6')-Ib、aph(3')-I、armA、sul1和sul2基因。結(jié)果：53株醫(yī)院感染CRAB對(duì)復(fù)方新諾明、妥布霉素較敏感，對(duì)其余13種抗菌藥物耐藥率均達(dá)50%以上，基因檢出率依次為：TEM 100%，OXA-23 96.23%，armA 90.57%，aac(6')-Ib 22.64%，aac(3)-I 26.42%，aph(3')-I 73.58%，sul1 30.19%，sul2 56.60%，SHV 3.77%，VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER未檢出。共14組耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株。結(jié)論：我院醫(yī)院感染CRAB的患者仍可考慮選用復(fù)方新諾明和妥布霉素進(jìn)行治療。我院定居并繁殖的CRAB耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的機(jī)制可能與TEM酶密切相關(guān)，攜帶OXA-23基因可能是耐碳青霉烯類抗菌藥物的重要因素，檢出率低的耐藥基因可能在耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物機(jī)制中的作用不大。我院不僅存在科室內(nèi)部的交叉感染，而且存在科室之間的交叉感染，應(yīng)加大力度做好感染控制工作。

耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌；耐藥；耐藥基因；醫(yī)院感染

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）已成為我國(guó)院內(nèi)感染的主要致病菌之一，2014年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)17所教學(xué)醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌占臨床分離革蘭陰性菌的14.23%，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌[1]。廣譜抗菌藥物的大量運(yùn)用使鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）的比例逐年增高，細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥即意味著對(duì)其他抗菌藥物基本耐藥[2]。重癥監(jiān)護(hù)病房收治的患者免疫力低下、侵入性操作多，并長(zhǎng)期使用各類廣譜抗菌藥物，感染CRAB的患者較多見(jiàn)。本研究重點(diǎn)考察重癥監(jiān)護(hù)病房醫(yī)院感染患者所分離CRAB的耐藥性，初步了解我院醫(yī)院感染CRAB的流行病學(xué)特點(diǎn)，并探討耐藥性與耐藥基因的關(guān)聯(lián)性，以期為分子生物學(xué)研究及臨床合理用藥提供理論參考。

1　材料和方法

1.1菌株來(lái)源

53株CRAB分離源自2014年1月– 2015年5月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）醫(yī)院感染患者不同來(lái)源的標(biāo)本（剔除同一患者同部位的重復(fù)標(biāo)本）。醫(yī)院感染判斷標(biāo)準(zhǔn)遵循《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》并結(jié)合臨床實(shí)際情況。

1.2細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

采用美國(guó)德靈Microscan WalkAway 4.0系統(tǒng)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)。質(zhì)控菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AE ATCC 27853購(gòu)自貴州省臨床檢驗(yàn)中心。藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。檢測(cè)菌株對(duì)阿米卡星、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、左氧氟沙星、美羅培南、哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、復(fù)方新諾明、替卡西林/克拉維酸、四環(huán)素、妥布霉素的敏感性。結(jié)果判定依據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3細(xì)菌處理

挑純培養(yǎng)菌，取1 mL細(xì)菌LB培養(yǎng)液于1.5 mL離心管內(nèi)，離心（12 000 r·min-1）1 min去上清，用1 mL無(wú)菌蒸餾水重新懸浮細(xì)菌沉淀，離心（12 000 r·min-1）1 min去上清，加蛋白酶K（200 ng·mL-1）溶液500 μL，56 ℃水浴2 h，然后于沸水中水浴10 min，離心（12 000 r·min-1）1 min，取上清液即為基因檢測(cè)的模板液，于– 20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4基因檢測(cè)

采用PCR法檢測(cè)15個(gè)耐藥基因，PCR儀為ABI2700型。引物序列根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI（www.ncbi. nlm.nih.gov/nucleotide）各基因序列完成設(shè)計(jì)，靶基因序列登錄號(hào)、引物序列及目的產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。各反應(yīng)體系為20 μL：上下游引物各l μL（10 μmol·L-1），dNTP 2 μL （2 mmol·L-1），10倍PCR緩沖液（含Mg2+）2 μL，TaqDNA 聚合酶1 U（不計(jì)體積），超純水12 μL，模板液2 μL。PCR擴(kuò)增熱循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性3 min，然后95 ℃ 30 s →55 ℃ ～ 62 ℃（根據(jù)引物的退火溫度）30 s → 72 ℃ 60 s，循環(huán)33個(gè)周期，最后72 ℃延長(zhǎng)5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)為英國(guó)Syngene公司的 G-BOX。

2　結(jié)果

2.1一般情況

53株CRAB中，急診ICU 11株，綜合ICU 26株，內(nèi)科ICU 9株，神經(jīng)ICU 6株，兒科ICU 1株；男性35株（66.04%），女性18株（33.96%）。詳見(jiàn)表2。

表1　耐藥基因PCR引物序列[3]Tab 1　PCR primer sequence of drug-resistant genes[3]

表2　CRAB的分類檢出情況Tab 2　The classification about the detection of CRAB

2.2耐藥情況分布

本研究檢測(cè)了53株醫(yī)院感染CRAB對(duì)15種抗菌藥物的耐藥情況，詳見(jiàn)表3。

表3　53株醫(yī)院感染CRAB的藥敏特點(diǎn)分布情況Tab 3　Distribution of the drug-sensitive characteristics of 53 strains of nosocomial acquired CRAB

2.3耐藥基因檢測(cè)情況分布

對(duì)妥布霉素敏感的16株CRAB，氨基糖苷類修飾酶基因檢出：armA（81.25%，13/16），aph(3')-I（75.00%，12/16），aac(3)-I（6.25%，1/16），aac(6')-Ib（0/16）。對(duì)復(fù)方新諾明敏感的33株CRAB，磺胺耐藥基因檢出：sul1（9.09%，3/33），sul2（48.48%，16/33）。詳見(jiàn)表4。

表4　53株醫(yī)院感染CRAB的耐藥基因檢測(cè)分布情況Tab 4　Distribution of the detection results of drug-resistant genes of 53 strains nosocomial acquired CRAB

2.4耐藥基因檢出與耐藥情況對(duì)比研究

共14組（每組2株細(xì)菌）耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株，其中綜合ICU 9組、神經(jīng)ICU 2組、急診ICU 2組和內(nèi)科ICU 1組。14組CRAB中，住院日期無(wú)交叉的有內(nèi)科ICU組（16號(hào)2014-03-28入院，2014-05-14出院；37號(hào)2014-06-01入院，2014-07-07出院）；綜合ICU組（17號(hào)2014-04-23入院，2014-07-31出院；81號(hào)2015-01-02入院，2015-01-31出院；88號(hào)2015-01-16入院，2015-04-13出院；92號(hào)2014-10-22入院，2014-11-03出院）。不同ICU耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株排列詳見(jiàn)表5。

3　討論

綜上，本研究結(jié)果提示，男性感染CRAB多于女性。鮑曼不動(dòng)桿菌院內(nèi)感染最常見(jiàn)的部位是肺部，是醫(yī)院獲得性肺炎尤其是呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎重要的致病菌[4]，CRAB多分離自痰標(biāo)本，考慮與重癥監(jiān)護(hù)病房患者多使用呼吸機(jī)相關(guān)。60歲以上老年人送檢痰標(biāo)本分離率最高，分析原因是由于老年患者呼吸器官退化，呼吸功能及咳嗽反射減弱，肺組織彈性減弱等導(dǎo)致排痰功能降低，更易在醫(yī)院內(nèi)感染CRAB引起肺炎。

本研究結(jié)果表明，CRAB除對(duì)復(fù)方新諾明、妥布霉素較敏感外，對(duì)其余13種抗菌藥物耐藥率均達(dá)50%以上（見(jiàn)表3），耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻。本院獲得的CRAB仍可考慮選用復(fù)方新諾明和妥布霉素進(jìn)行治療,與湖北黃石、蘇州、廣東省中山市的報(bào)道結(jié)果并不一致[5-7]。產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶是鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的重要機(jī)制[2]，產(chǎn)酶與攜帶耐藥基因相關(guān)。53株CRAB對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物均耐藥，同時(shí)所有菌株均攜帶TEM基因，故我院定居并繁殖的CRAB耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的機(jī)制可能與TEM酶密切相關(guān)。有研究[8]曾證明OXA-23型碳青霉烯酶在鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥中起著重要作用。攜帶OXA-23基因可能是本院鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類抗菌藥物的重要因素。SHV檢出低，VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER均未檢出，檢出率低的耐藥基因可能在本院分離CRAB耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物機(jī)制中的作用不大。研究氨基糖苷類修飾酶基因和磺胺耐藥基因發(fā)現(xiàn)，對(duì)妥布霉素敏感的CRAB高檢出armA、aph(3')-I，低檢出aac(3)-I、aac(6')-Ib，對(duì)復(fù)方新諾明敏感的CRAB高檢出sul2，低檢出sul1，其關(guān)聯(lián)性有待進(jìn)一步探討。

表5　各ICU耐藥基因和藥敏特點(diǎn)相同的菌株分布情況Tab 5　Distribution of the same drug resistance gene and drug sensitive characteristics of strains in each ICU department

考慮耐藥情況和耐藥基因檢出完全一致的菌株可能具有同源性，提示我院不僅存在科室內(nèi)部的交叉感染，且存在科室間的交叉感染，尤其是內(nèi)科ICU和綜合ICU存在長(zhǎng)期定植菌，說(shuō)明臨床的清潔消毒工作不徹底，科室之間傳播的流行病學(xué)特點(diǎn)值得深入研究。

[1] 胡付品，朱德妹，汪復(fù)，等.2014年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志，2015，15（5）：401-410.

[2] Peleg AY,Seifert H,Paterson DL. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen[J]. Clin Microbiol Rev,2008,21(3): 538-582．

[3] Opazo A,Domínguez M,Bello H,et al. OXA-type carbapenemases in Acinetobacter baumannii in South America[J]. J Infect Dev Ctries,2012,6(4): 311-316.

[4] 陳佰義，何禮賢，胡必杰，等.中國(guó)鮑曼不動(dòng)桿菌感染診治與防控專家共識(shí)[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)雜志，2012，92（2）：76-85.

[5] 鮑群麗，汪宏良，柯俊.耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分布及耐藥譜動(dòng)態(tài)觀察[J].中國(guó)感染控制雜志，2015，14（5）：311-313，316.

[6] 錢何布，浦秦華，倪曉艷，等.耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性及其所致醫(yī)院獲得性肺炎的危險(xiǎn)因素[J].中華臨床感染病雜志，2015，8（2）：113-117.

[7] 陸丹倩，顧向明，鄭煥東，等.耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的分布及耐藥性分析[J].中國(guó)感染與化療雜志，2015，15（2）：175-177.

[8] Héritier C,Poirel L,Lambert T,et al. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii[J]. Antimicrob Agents Chemother,2005,49(8): 3198-3202.

The study and analysis of drug resistance genes of nosocomial infection CRAB in ICU

CHEN Lu,LI Ling-zhu,LENG Ying-rong,ZHA Zhu-hong,CHENG Yong-su,HUANG Bing,LUO Guang-ying,WANG Min,JIANG Yin-hui(The Infection Control Section of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China)

Objective: To analyze the situation of antimicrobial resistance,related resistance genes and possible mechanism,and provide references for rational antimicrobial application and discover the epidemiological characteristics of CRAB in our hospital. Methods: PCR techniques were used to test OXA-23,TEM,SHV,VEB,CARB,DHA,VIM,IMP,PER,aac(3)-I,aac(6')-Ib,aph(3')-I,armA,sul1 and sul2 genes. Results: In addition to SMZ-TMP and tobramycin,resistant rate to 13 antibiotics were all over 50%. The detection rate of gene were TEM 100%,OXA-23 96.23%,armA 90.57%,aac(6')-Ib 22.64%,aac(3)-I 26.42%,aph(3')-I 73.58%,sul1 30.19%,sul2 56.60% and SHV 3.77%. VEB,CARB,DHA,IMP,VIM and PER were not detected. There were 14 bacterial groups which had the same drug resistance and drug resistance gene. Conclusion: SMZ-TMP and tobramycin can be used to cure the CRAB infected patients. The TEM gene may be closely related to β-lactams resistance. The OXA-23 may be a crucial factor for carbapenems resistance. Those genes with low detection rate may not play a big role in drug resistant mechanism. There are cross infection in the same department and among departments in our hospital,infection control should be strengthened.

Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii; Drug resistance; Drug resistance gene; Nosocomial infection

R978.1

A

1672 - 8157(2016)01 - 0052 - 04

貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合SY字2013-3176號(hào)）

冷應(yīng)蓉，女，主任技師，主要從事醫(yī)院感染管理。E-mail：49728467@qq.com

陳璐，女，主治醫(yī)師，主要從事病原菌耐藥機(jī)制研究。E-mail：49728467@qq.com

（2015-10-11

2015-12-16）