一株放線菌藍色素的提取及相關研究

李增政　韋瑤　梁亞平　曹雪蓮　肖齊勝

摘 要 從百合鱗莖中發現一株產藍色素的放線菌，應用發酵和平板培養兩種方法生產藍色素，采用酸堿法提取了該菌的藍色素粗提物，并對這兩種生產所得的藍色素粗提物分別進行了抑菌活性、溫度等的實驗，發現該綠色素粗提物對肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等具有拮抗性；在4-60℃溫度下平板生產的色素比用發酵生產的色素要穩定。

關鍵詞 藍色素 抑菌活性 溫度 酸堿法 發酵

中圖分類號：Q939.9 文獻標識碼：A

0前言

次級代謝產物是指生物生長到一定階段后通過次級代謝合成的分子結構十分復雜、對該生物無明顯生理功能，或并非是該生物生長和繁殖所必需的小分子物質，如抗生素、毒素、激素、色素等。色素廣泛應用于食品、服裝、化妝品等行業，藍色素作為三種基本顏色之一，可與紅、黃色素調配稱多種色調，所以開發藍色素在各個領域中的應用具有很大的現實意義和良好的市場前景。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1目標菌株

從百合鱗莖中分離所得具有產生藍色素功能的放線菌。

1.1.2 主要試劑和藥品

75% 乙醇溶液、大量高溫滅菌的蒸餾水、無水乙醇、無水乙酸乙酯、甘油、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、重鉻酸鉀、制霉菌素、放線菌酮、萘啶酮酸等。

1.1.3主要器材及儀器

9cm培養皿、剪刀，鑷子，酒精燈，酒精棉球，移液槍，槍頭（藍色，黃色）、超凈工作臺、蒸汽滅菌鍋、搖床培養箱、1000ml錐形瓶、打孔器、離心機、旋轉蒸發儀、冷凍干燥機等。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基及抑菌劑的配制

改良高氏I號：可溶性淀粉 20 g；K2HPO4·3 H2O，0.5 g；MgSO4·7H2O，0.5 g；FeSO4·7H2O，0.01g；KNO31 g；NaCl0.5g；Distilled water1000ml；瓊脂18g。

抑菌劑：重鉻酸鉀（50 g/mL），萘啶酮酸（20 g/mL），放線菌酮（50 g/mL），制霉菌素（50 g/mL）。

發酵種子培養基：可溶性淀粉15g，葡萄糖5g，黃豆粉10g，氯化鈉1g，蛋白胨5g，酵母提取物5g，碳酸鈣5g，蒸餾水1000ml，PH7。

發酵培養基：黃豆餅粉20g，酵母粉15g，葡萄糖10g， K2HPO4 1g， 碳酸鈣3g，氯化鈉1g，蒸餾水1000mL，PH7.2左右。

1.2.2放線菌的培養

將所得的目標菌株采用平板劃線法劃到改良高氏I號固體平板上，置于恒溫培養箱中培養，溫度為23—26℃。培養5天左右就可以看到平板上的白色菌落，15天左右就可看到平板上有藍色素產生。

1.2.3發酵

從生長到對數期的平板中挑取一定數量的單個菌落接種于種子培養基中培養，種子培養基于搖床中160r/min培養溫度26℃ 培養時間3天左右。種子培養基占發酵培養基的10%。

將活化兩天以后的種子培養基接種于發酵培養基中，溫度26℃ PH7.2置于160r/min搖床中發酵直至發酵培養基變成藍綠色為止。（方法一）

1.2.4平板培養法

將該菌采用平板劃線法劃到改良高氏I號固體平板上，置于培養箱中培養，溫度為23—26℃。培養至平板完全變成藍色為止，然后將平板浸泡在無菌水中帶水溶液變成藍色為止。（方法二）

1.2.5色素提取

提取方法采用酸堿提取法，將發酵液和浸泡液分別調PH至12然后4℃ 4000r離心10分鐘：將離心后的上清PH調至1—2，再次4℃ 4000r離心10分鐘；最后去上清將沉淀物真空冷凍干燥得到藍色素粗提物。

1.2.6色素抑菌活性實驗

抑菌活性采用濾紙片法濾紙片直徑為9mm，溶劑采用三種分別是蒸餾水（1）、99.9%乙醇（2）、乙酸乙酯（3），色素粗提物濃度均為0.003g/ml。操作時將濾紙片浸濕在色素粗提物溶液中然后待風干以后再操作

方法一生產的色素抑菌活性：

方法二生產的色素抑菌活性

1.2.7溫度對色素粗提物的影響

方法二所生產的色素：

方法二生產的色素0.1g溶于50ml水中：

方法一生產的色素0.15g溶于50ml水中：

應用兩種生產色素方法來生產色素，提取色素粗品以后進行溶解時發現：方法一生產的色素需要將PH調為11—12（起始PH為2.8）才能變成藍色放置一段時間后溶液會變成黃色，而應用方法二生產的色素溶于水以后溶液直接變成藍色長時間保存不變色。

2結果及分析

應用兩種方法生產所得的色素在色澤上差異很大。方法一所得的色素需要經過調節PH才能呈現藍色但是暗淡，在常溫下放置一段時間后會變成黃色，在熱水80€凹？0€耙隕霞尤？0s會變成黃色在溫度對色素的影響實驗中也發現隨著溫度升高OD值逐步減小，顏色也越來越淡偏向黃色所以應用該方法所生產的藍色素不穩定；方法二所得的色素色澤鮮亮藍色明顯，常溫下放置不會變色加熱到90€耙膊換岜瀋琌D值也沒有呈現逐步減小，所以方法二所生產的色素相對比較穩定。

在抑菌活性實驗中，兩種方法所生產的色素均表現出了不同的抑菌活性其中金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、大腸桿菌是兩種色素在乙醇和乙酸乙酯溶劑下都有抑菌活性，不同方法生產的色素在不同溶劑中表現出來的抑菌活性有著明顯不同，造成這種原因是因為生產方式的不同；而相同色素在相同溶劑下對同一株菌的抑菌活性不同可能是因為色素是粗提物里面物質多樣在不同溶劑中表現出了不同溶解度。

基金來源：國家級大學生創新創業訓練計劃項目《一株產藍色素放線菌的色素提取及相關研究》項目編號：201610742073。

參考文獻

[1] 趙珂，等.攀西地區藥用植物內生及根際放線菌的多樣性與抗菌活性研究[J]四川大學博士學位論文，2011：74-124.

[2] 沈萍，陳向東.微生物學（第二版）[M].高等教育出版社，1999（10）：79-84.