固本補腎口服液的總黃酮含量測定方法研究

韋瑀龍，黃小鷗，藍曉慶

?

固本補腎口服液的總黃酮含量測定方法研究

韋瑀龍1，黃小鷗1，藍曉慶2

目的 建立固本補腎口服液總黃酮的含量測定方法。方法 比較HCl-Mg法、AlCl3法、NaNO2-AlNO3-NaOH法3種不同顯色方法，以及槲皮素、淫羊藿苷、蘆丁3種對照品的波長掃描圖譜，確定測定條件。結果 以NaNO2-AlNO3-NaOH法顯色，蘆丁為對照品，508 nm波長條件下測定，蘆丁在0.105 5～1.107 5 mg/mL間線性關系良好(R2=1.000 0)，樣品平均回收率98.83% (RSD=1.17%)。結論 NaNO2-AlNO3-NaOH法顯色適用于固本補腎口服液總黃酮含量的初步測定。

固本補腎口服液；總黃酮；NaNO2-AlNO3-NaOH顯色

0 引言

固本補腎口服液由黃芪、淫羊藿、枸杞、桑寄生、麥冬、牛膝、菟絲子、杜仲、黃精組方而成，具有固本培元、補腎生精等功效，主要用于腎虛陽痿、早泄、精液異常，為廣西名老中醫荀建寧教授臨床驗方，其主要藥味黃芪、淫羊藿、桑寄生的主要化學成分之一均為黃酮。本文擬通過研究固本補腎口服液中總黃酮的含量測定方法，為建立其質量控制方法奠定基礎。近年來金屬離子絡合法已成為測定總黃酮含量應用最廣泛的方法，其原理是在一定條件下，金屬離子與黃酮發生絡合反應，形成有顏色的螯合物，用比色法測定總黃酮的含量，其最常用的顯色方法有HCl-Mg法、AlCl3法、NaNO2-AlNO3-NaOH法，本文通過對這3種方法條件下槲皮素、淫羊藿苷、蘆丁3種對照品的考察，建立適用于本品的總黃酮含量測定方法。

1 儀器與試藥

CQ-250超聲波清洗機(上海躍進醫用光學器械廠)，53WBI微機型紫外-可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)，電子分析天平(GR-202，日本)，槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-200907)，淫羊藿苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：0737-9910)，蘆丁對照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-15091104，供UV測定用)，固本補腎口服液(廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院制劑室，20 mL/支，批號：20151222、20151226、20151228)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 精密吸取本品4.0 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取稀釋液1.0 mL置10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品42.1 mg，置100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.421 mg/mL的對照品溶液。

2.3 測定法 精密吸取供試品溶液2.0 mL置25 mL 量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以未加入硝酸鋁顯色的上述樣品液為參比空白，立即在508 nm波長下測定吸光度(蘆丁對照品的測定以相應的試劑為空白)。

2.4 顯色方法及對照品考察

2.4.1 HCl-Mg法[1]精密吸取蘆丁、淫羊藿苷(0.420 mg/mL)、槲皮素(0.440 mg/mL)對照品溶液及供試品溶液各1.0 mL，分別置于加有鎂粉300 mg的試管中，將試管置冷水浴(約15 ℃)中，緩慢滴加濃鹽酸3 mL并不時振搖試管，加70%乙醇補足至10 mL，搖勻，置沸水浴中加熱約15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應試劑為空白，于400～700 nm 進行波長掃描。結果蘆丁、淫羊藿苷與供試品在此波長段有相近的吸收峰值。但多次預試驗結果表明，該反應過程劇烈，反應液中含有的乙醇更使反應結果的重復性難以控制。同時，該法對多數異黃酮類成分不顯色[2]，這與本品的主要藥味-黃芪主要含異黃酮類成分不相符[3]，故不宜采用此法作為本品總黃酮的測定方法。

2.4.2 AlCl3法[4]取“2.4.1”項下的供試品溶液、對照品溶液各1.0 mL，分別置于20 ℃水浴鍋中放置的10 mL量瓶中，加入0.1 mol/L AlCl3溶液3 mL，然后加入1 mol/L NaAc溶液4 mL，反應2 min后取出，用70%乙醇定容，待溶液溫度降至室溫，供試品以未加AlCl3溶液的上述供試品測定液作為空白，對照品以相應的試劑為空白，在400～700 nm 掃描。結果蘆丁與槲皮素在417 nm有最大吸收，而供試品在此波長段無吸收峰。

2.4.3 NaNO2-AlNO3-NaOH法[5]取“2.4.1”項下的供試品溶液、對照品溶液各2.0 mL置25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，供試品以未加AlCl3溶液的上述供試品測定液作為空白，對照品以相應的試劑為空白，立即在400～700 nm掃描。結果供試品與蘆丁在500 nm左右皆有吸收峰，且峰形對稱(見圖1)，而槲皮素、淫羊藿苷在此波長段無吸收峰。蘆丁吸收峰值508 nm，供試品吸收峰值495 nm，故選擇以蘆丁為對照品在508 nm處測定供試品吸光度。

圖1 NaNO2-AlNO3-NaOH顯色波長掃描圖譜

2.5 方法學考察

2.5.1 線性范圍考察 精密吸取蘆丁對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分別置25 mL量瓶中，照“2.3”項下的方法，自“加水至6 mL”起依法操作，測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標，濃度(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.881 28X-0.000 01，R2=1.000 0，表明蘆丁在0.105 5～1.107 5 mg/mL線性關系良好。

2.5.2 重復性試驗 按“2.3”項下方法平行制備6份供試品測定液，測定吸光度，結果總黃酮含量RSD=1.36%，表明本方法重復性良好。

2.5.3 精密度試驗 取同一供試品測定液連續測定6次，結果RSD=0.46%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩定性試驗 取同一供試品測定液于0、5、10、15 min測定吸光度，結果RSD=2.07%，表明供試液在15 min內穩定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密吸取已知總黃酮含量(7.290 mg/mL)的樣品溶液4.0 mL，置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取稀釋液0.5 mL置10 mL量瓶中，再精密加入蘆丁對照品1.684 mg，照“2.3”項下的方法，自“加水至6 mL”起依法操作，以上述未加硝酸鋁溶液的試液為參比空白測定吸光度，計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.6 樣品測定 取3批固本補腎口服液，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3”項下方法依法顯色、測定總黃酮含量。結果見表2。

3 討論

NaNO2-AlNO3-NaOH法顯色原理：亞硝酸鈉還原被氧化的酚羥基，使其能與鋁離子絡合，并提供一個堿性環境(酸性環境中鋁離子不與鄰二酚羥基絡合)，絡合之后，產生一個穩定的特征吸收峰，再加入氫氧化鈉使酚羥基解離，形成p-π共軛，使吸收峰紅移至可見光區，避免雜質干擾(雜質不紅移)。鄰二酚羥基是該反應的關鍵功能基團，而且鄰二酚羥基的鄰位無取代基也是必需條件之一[6]。

供試品溶液NaNO2-AlNO3-NaOH顯色后，穩定性較差，顯色后室溫下放置5、10、15 min后，吸光度分別降低0%、2.0%、4.3%，15 min時RSD>2%，因此，顯色后應盡快測定樣品。這與《中國藥典》中采用該法測定總黃酮時，要求顯色完成后“立即照紫外-可見分光光度法測定”相符，而與部分文獻報道的數據不一致[7-8]。

表2 三批樣品測定結果

中藥供試品往往因成分復雜，不經顯色處理在測定波長下也有一定的吸光度，依據本法的顯色原理，文中采用未加絡合離子(AlNO3)的供試品溶液作為供試品測定液的空白，以消除本底及其他成分對亞硝酸鈉、氫氧化鈉顯色的影響。

[1] 黨曉芳,曹颯,祁娟娟,等.鬼箭羽總黃酮含量測定方法的建立[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(9):96-98.

[2] 匡海學.中藥化學[M].北京:中國中醫藥出版社,2011.

[3] 李春紅,田吉,何兵,等.紫外分光光度法測定黃芪總黃酮的含量[J].重慶醫科大學學報,2011,36(8):954-956.

[4] 張明,陳華國,趙超,等.杠板歸中總黃酮的含量測定[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(18):77-80.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫藥科技出版社,2015.

[6] 郭亞健,范莉,王曉強,等.關于NaNO2-AlNO3-NaOH比色法測定總黃酮方法的探討[J].藥物分析雜志,2002,22(2):97-99.

[7] 李春紅,田吉,何兵,等.紫外分光光度法測定黃芪總黃酮的含量[J].重慶醫科大學學報,2011,36(8):954-965.

[8] 常飛,吳文能,曹暉.白補藥總黃酮含量測定該法的建立[J].天然產物研究與開發,2016,28(82):71-76.

Optimization of determination for total flavonoids in Guben bushen oral liquid

WEI Yu-long1,HUANG Xiao-ou1,LAN Xiao-qing2

(1.Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,China;2.Guangxi Jia Ye Technology Co.Ltd,Nanning 530001,China)

Objective To establish a method for the determination of the content of total flavonoids in Guben bushen oral liquid.Methods Both three coloration methods and three

ubstances were studied to find the ideal coloration method and determination conditions.Results The sample was detected at 508 nm wavelength by NaNO2-AlNO3-NaOH reaction with Botanic as reference substance.Botanic had a liner relationship with absorbance in the range of 0.105 5～1.107 5 mg/mL(R2=1.000 0),and the average recovery rate was 98.83% withRSDof 1.17%.Conclusion The NaNO2-AlNO3-NaOH coloration method is applicable for the determination of total flavonoids in Guben bushen oral liquid.

Guben bushen oral liquid;Total flavonoids;NaNO2-AlNO3-NaOH coloration method

2016-03-08

1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，南寧 530001；2.廣西佳業科技有限公司，南寧 530001

廣西壯族自治區衛生廳中醫藥科技專項(GZZJ13-11)

10.14053/j.cnki.ppcr.201610020