骨癆敵注射液HPLC指紋圖譜研究

劉虹霞，張譯丹，張國剛*

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·藥學研究·

骨癆敵注射液HPLC指紋圖譜研究

劉虹霞1，張譯丹2，張國剛1*

目的 建立中藥復方制劑骨癆敵注射液的HPLC指紋圖譜分析方法，對制劑的質量進行控制。方法 采用ECOSIL C18柱(250 mm × 4.60 mm,5 μm)，以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：203 nm，進樣量：10 μL。結果 通過對25批制劑進行指紋圖譜分析，標定出9個共有峰。采用對照品指認了毛蕊異黃酮葡萄糖苷、柚皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1 5個色譜峰。并運用“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度計算軟件”，計算25批注射液的相似度在0.985 ～ 0.997之間。結論 所建立的HPLC指紋圖譜分析方法專屬性強、重復性良好，可用于骨癆敵注射液的質量評價。

骨癆敵注射液；指紋圖譜；HPLC；質量控制

0 引言

骨癆敵注射液是由5味藥材組成的中藥復方制劑，其藥味分別為黃芪、三七、骨碎補、乳香和沒藥。骨癆敵注射液具有益氣養血、補腎壯骨、活血化瘀的功效，用于骨關節結核、淋巴結核、肺結核等各種結核病以及瘤型麻風病等癥。中藥及其制劑均為多組分復雜體系，因此,評價其質量應采用與之相適應的、能提供豐富鑒別信息的檢測方法，但現行的顯微鑒別、理化鑒別和含量測定等方法都不足以解決這一問題。而中藥指紋圖譜能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學成分的種類與數量，進而對藥品質量進行整體描述和評價，這也正好符合中醫藥整體學說。因此，筆者結合相關文獻[1-5]，對骨癆敵注射液的HPLC指紋圖譜進行研究，為其質量控制方法提供科學依據。

1 儀器與材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀(配有DAD檢測器，Chemstation system化學工作站，美國Agilent公司)，AE240十萬分之一電子天平(瑞士Mettler公司)。

骨癆敵注射劑(規格：2 mL/支，批號：091201、091202、091203、110401、110402、110403、110404、110405、1207001、1207002、1207003、1207004、1207005、1207006、1207007、1207008、1207009、1207010、1208001、1208002、1209001、12009003、1209006、1210001、1210003，沈陽藥科大學天然藥物化學實驗室)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號：111920-201102，中國藥品生物制品檢定所)，柚皮苷(批號：110722-200309，中國藥品生物制品檢定所)，三七皂苷R1(批號：0745-200006，中國藥品生物制品檢定所)，人參皂苷Rg1(批號：110703-200726，中國藥品生物制品檢定所)，人參皂苷Rb1(批號：110704-200217，中國藥品生物制品檢定所)，娃哈哈純凈水(純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司)，乙腈(色譜純，天津康科德科技有限公司)，甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：ECOSIL C18柱(250 mm × 4.60 mm，5 μm)，以乙腈為流動相A、水溶液為流動相B，按表1程序進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為203 nm，進樣量為10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備 供試品溶液：取骨癆敵注射液1支，用0.45 μm濾膜濾過，即得。

對照品溶液：取柚皮苷對照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品、三七皂苷R1對照品、人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品各適量，精密稱定，分別加10%甲醇溶液制成每1 mL含柚皮苷 0.40 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷 0.35 mg、三七皂苷R1 0.35 mg、人參皂苷Rg1 0.50 mg、人參皂苷Rb1 0.25 mg的對照品溶液，用0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.3 共有峰的標定及對照指紋圖譜 將25批骨癆敵注射液按“2.1”項的色譜條件進樣分析(見圖1)，以出現率100%計，取各批次制劑指紋圖譜中的典型色譜峰作為共有指紋峰，標定出9個共有峰，并運用“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度計算軟件”，采用平均數法生成注射液對照指紋圖譜(見圖2)。

圖1 25批骨癆敵注射液色譜圖

2.4 共有峰的指認 與對照品色譜峰對比可以確定：4號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，6號峰為柚皮苷，7號峰為三七皂苷R1，8號峰為人參皂苷Rg1，9號峰為人參皂苷Rb1，色譜圖見圖3，以6號峰即柚皮苷色譜峰為參比峰。

圖2 骨癆敵注射液對照指紋圖譜

圖3 骨癆敵注射液共有峰指認

2.5 共有峰峰純度測定 應用DAD檢測器，按“2.1”項的色譜條件對供試品溶液進行全掃描，測定各共有峰的峰純度，結果見表2。各色譜峰的峰純度均不小于85.0%，表明各共有峰與鄰近色譜峰分離度良好，無色譜峰重疊現象。

表2 峰純度結果

2.6 方法學驗證

2.6.1 儀器精密度試驗 取同一批(批號：110404)供試品溶液，連續進樣6次，按“2.1”項的色譜條件分析，計算各共有峰與參比峰(6號峰)的相對保留時間和相對峰面積，并計算其相對標準偏差(RSD)。結果各色譜峰的相對保留時間的RSD均小于0.2%，相對峰面積的RSD均小于3.3%，表明各色譜峰較為穩定，儀器精密度良好。

2.6.2 重復性試驗 取同一批樣品(批號：110404)，按“2.2”項平行制備6份供試品，按“2.1”項的色譜條件進樣分析，計算各共有峰與參比峰(6號峰)的相對保留時間和相對峰面積，并計算其RSD。結果各色譜峰的相對保留時間的RSD均小于0.3%，相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明該方法具有一定重復性。

2.6.3 溶液穩定性試驗 按“2.2”項制備供試品溶液，于常溫下保存，分別在0、4、8、12、16和24 h進樣，按“2.1”項的色譜條件分析，計算各共有峰與參比峰(6號峰)的相對保留時間的RSD均小于0.2%，相對峰面積的RSD均小于4.5%，結果表明，供試品溶液在24 h內對指紋研究無影響。

2.7 相似度分析 運用“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度計算軟件”對25批注射液的色譜圖進行處理，經色譜峰自動匹配生成骨癆敵注射液的HPLC指紋圖譜共有模式，見圖4。通過“相似度計算”功能進行色譜圖譜樣本與對照指紋圖譜的相似度評價，結果見表3。25批注射液之間相似度結果良好，說明各批次間注射液差別較小，質量穩定。

圖4 25批骨癆敵注射液指紋圖譜疊加圖

批號相似度批號相似度0912010.98512070060.9910912020.98712070070.9960912030.99312070080.9961104010.99612070090.9971104020.98712070100.9961104030.98712080010.9961104040.99312080020.9961104050.99312090010.99312070010.99612090030.99312070020.98812090060.99312070030.99612100010.99212070040.99012100030.98512070050.987

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 根據骨癆敵注射液色譜圖研究在各波段下的吸收情況，結果顯示，203 nm波長下，色譜峰較多，吸收較強，分離也較好，故選定檢測波長為203 nm。見圖5和圖6。

圖5 骨癆敵注射液3D光譜圖

圖6 骨癆敵注射液各波長色譜圖疊加圖

3.2 梯度洗脫的選擇 筆者選擇了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(冰醋酸)等多種流動相系統對注射劑進行梯度洗脫，結果表明，乙腈-水為流動相時各個色譜峰的分離度較好(203 nm檢測)，基本達到基線分離，因此，選擇此流動相為骨癆敵注射液指紋圖譜檢測的流動相系統。

3.3 共有峰歸屬 骨癆敵注射液共確定9個共有峰，其中4號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，為黃芪的有效成分[6]；6號峰為柚皮苷，為骨碎補的有效成分[7]；7、8、9號峰分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1，均為三七的有效成分[8]。

[1] 熊明玲,劉凱南,高厚明,等.骨碎補高相液相指紋圖譜構建與應用[J].藥物研究,2011,20(5):4-5.

[2] 黎瓊紅,張國剛.三七藥材的指紋圖譜[J].沈陽藥科大學學報,2006,23(4):229-232.

[3] 王二麗,劉巧,陳丹,等.中藥黃芪指紋圖譜分析研究概況[J].福建分析測試,2005,14(4):2329-2331.

[4] 崔秀明,董婷霞,陳中堅.三七及其混淆品的HPLC指紋圖譜鑒定[J].中草學,2002,33(10):941-943.

[5] 謝培山.中藥色譜指紋圖譜[M].北京:人民衛生出版社,2005.

[6] 邱勇波,劉錦,武飛.黃芪化學成分及藥理作用研究進展 [J].中國療養醫學,2011,20(5):435.

[7] 尚振平,趙慶春,潭菁菁,等.骨碎補的化學成分 [J].實用藥物與臨床,2010,13(4):263-277.

[8] 袁延強.三七的化學成分研究[D].沈陽：沈陽藥科大學,2008:8-9.

HPLC fingerprint study of Gu laodi injection

LIU Hong-xia1,ZHANG Yi-dan2,ZHANG Guo-gang1*

(1.School of Traditional Chinese Materia Medica,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China;2.Liaoning Province Shiyan High School,Shenyang 110841,China)

Objective To establish an HPLC fingerprints analysis method for the quality control of the compound Chinese medicine Gu laodi injection.Methods The separation was performed on a ECOSIL C18column(250 mm×4.60 mm,5 μm) by gradient elution with acetonitrile-water as the mobile phase,the flow rate at 1.0 mL/min,the column temperature at 30 ℃,the detection wavelength at 203 nm and the injection volume at 10 μL.Results By the fingerprint analysis of 25 batches of injection,we had pinpointed 9 common peaks.The peaks of calycosin-7-glucoside,naringin,notoginsenoside R1,ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rb1 were identified.The similarity of 25 batches of injection was about 0.985 to 0.997 by using traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity calculation software.Conclusion The HPLC fingerprints analysis method is specific and reproducible,and it can be used to assess the quality of Gu laodi injection.

Gu laodi injection;Fingerprint;HPLC;Quality control

2016-08-10

1.沈陽藥科大學中藥學院，沈陽 110016；2.遼寧省實驗中學，沈陽 110841

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201610018