復方金銀花外洗液體外抗炎作用的實驗研究

黃開遠，吳群華，謝展雄，劉江紅

?

復方金銀花外洗液體外抗炎作用的實驗研究

黃開遠，吳群華，謝展雄，劉江紅

目的 對復方金銀花外洗液的體外抗炎作用進行研究。方法 采用MTT法測定復方金銀花外洗液對RAW264.7細胞活性的影響；采用ELISA法觀察RAW264.7細胞上清液中TNF-α、IL-6的分泌情況；采用Western-blot法檢測TNF-α、IL-6蛋白的表達情況。結果 MTT結果顯示，復方金銀花外洗液在0～210 μL/mL對RAW264.7細胞活力無顯著影響(P>0.05)；同時，金銀花外洗液能夠抑制LPS誘導的RAW264.7細胞的增殖活性，且呈劑量依賴性。ELISA檢測結果顯示，模型組細胞培養上清中TNF-α、IL-6含量顯著升高，與正常組相比差異有統計學意義(P<0.01)，復方金銀花外洗液中、高劑量組培養液上清中TNF-α、IL-6含量低于模型組(P<0.05)。Western blot結果顯示，模型組中TNF-α、IL-6的蛋白含量明顯高于正常組(P<0.01)，不同濃度外洗液處理后，炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白表達水平顯著降低，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論 復方金銀花外洗液在細胞水平的主要抗炎作用與抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白表達水平有關。

金銀花外洗液；外用；抗炎作用

0 引言

中藥外洗是中醫外治法的一個重要治療手段，主要應用集中在足、踝、膝等下肢關節部位。外洗液發揮的藥理藥效作用主要是通過透皮吸收或是抑制表面真菌的增長和增殖。

復方金銀花外洗液(外洗液)是我院在復方黃柏液的基礎上加減而成，由金銀花、苦參、黃柏、蛇床子、土茯苓五味藥組成。具有清熱解毒、燥濕止癢抗真菌的功效。臨床上主要應用于因真菌感染引起的疥癬、腳癢，及足部濕疹等疾病。本實驗采用內毒素(LPS)誘導小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)作為炎癥模型。以炎癥因子TNF-α、IL-6為指標，觀察復方金銀花外洗液在細胞水平的抗炎抗菌作用。為復方金銀花外洗液具有燥濕止癢的功效提供實驗依據，同時為下一步的實驗研究提供理論基礎。

1 材料與試劑

1.1 儀器 AB16UU型CO培養箱(德國Heraeus公司)；XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光電公司)；PURIFIATION EQUIPMENT超凈臺(蘇州凈化設備有限公司)；RT2100C酶標分析儀(深圳雷杜生命科技有限公司)；UW220分析天平(日本島津)。

1.2 試藥 金銀花、苦參、蛇床子、黃柏、土茯苓購自廣東康美藥業有限公司，高糖培養基、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)均為Gibco公司產品，培養瓶、培養板、培養皿等耗材均購于美國Corning公司，噻唑藍(MTT)、內毒素(LPS)均購于美國Sigma公司，其他試劑均為分析純。TNF-α、IL-6 兔抗小鼠多克隆抗體及TNF-α、IL-6 ELISA Kit均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 細胞 小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)購買于上海中科院細胞庫。

2 方法

2.1 外洗液的制備 按2份處方量的藥材加蒸餾水提取2次，比例為1∶12、1∶8，第1次1 h、第2次40 min，合并提取液并濃縮成1.0 g/mL，儲存于4 ℃冰箱備用。

2.2 細胞分組 將生長良好的RAW264.7細胞隨機分為5組，①空白組：RAW264.7；②模型組：LPS (0.2 μg/mL，下同)；③外洗液低濃度+LPS組；④外洗液中濃度+LPS組；⑤外洗液高濃度+LPS組。

2.3 MTT檢測細胞活性 ①將對數生長期的細胞濃度調整為5×104個/mL，在96孔板中每孔加入細胞10 μL/孔(約5×103個)，置37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h。②培養細胞24 h后，加入適當濃度的藥物，每個處理設5個平行組，每組設5個復孔。③將96孔板在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育24 h，每孔加10 μL 5 mg/mL MTT，繼續培養4 h，吸出上清液，每孔加100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。④用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測量各孔的吸光值。⑤結果分析：細胞存活率%=(測試孔OD值-本底OD值)/(對照組OD值-本底OD值)×100%，本底OD值是在完全培養基加入MTT(無細胞)后，酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測出其吸光值(OD)。

2.4 ELISA試劑盒檢測細胞分泌上清中TNF-α、IL-6的表達情況 按照“2.2”項下細胞分組情況，加入相應藥物培養24 h后，吸取細胞上清液，按試劑盒說明操作，用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)，繪制標準曲線圖，計算樣品濃度。

2.5 Western blot分析TNF-α、IL-6的表達 細胞培養6孔板中，4孔為1個樣本，按照“2.2”項下細胞分組情況，在收集上清液后，用PBS沖洗1次，吸棄PBS，胰蛋白酶消化并收集細胞，加入細胞裂解液，4 ℃、12 000 r/min 離心25 min，將所得上清液用Bradford法行蛋白含量測定后，放-80 ℃冰箱保存。將制備的蛋白樣本進行凝膠電泳，電泳后用電轉膜法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，一抗為TNF-α、IL-6抗體，二抗為羊抗兔辣根過氧化物酶的抗體，β-actin蛋白作為對照。利用ECL化學發光法進行顯色反應。檢測結果以X光膠片曝光。圖片掃描保存為電腦文件，用Image J(NIH 美國)成像系統軟件對Western blot條帶進行灰度值掃描并分析結果。

3 結果

3.1 復方金銀花外洗液對細胞活力的影響 各孔OD值大小與細胞活力呈正比，各組吸光度統計值見表1。如表1所示，外洗液作用于RAW264.7細胞24 h后，30～210 μL/mL組的細胞活力與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 不同濃度外洗液對RAW264.7細胞存活率的影響(n=5)

3.2 復方金銀花外洗液對LPS誘導的RAW264.7細胞活力的影響 如表2所示，0.2 μg/mL LPS作用細胞24 h后，與正常組比較，細胞活力增加到115.63，差異有統計學意義(P<0.05)，表明0.2 μg/mL LPS作用RAW264.7細胞24 h后，能促進細胞的增殖活力。外洗液作用于LPS誘導的細胞后，能夠劑量依賴性地抑制細胞的增殖活性。其中60、90、120 μL/mL外洗液可基本取消LPS對細胞活力的增強作用(細胞存活率為100%±5%)，因此，選定這3個劑量濃度作為后續實驗細胞的給藥濃度。

3.3 復方金銀花外洗液對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放TNF-α、IL-6的影響 ELISA檢測結果見表3。正常組RAW264.7細胞上清液中TNF-α、IL-6水平較低，給予0.2 μg/mL LPS刺激后，模型組中TNF-α、IL-6的含量增加，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，外洗液中、高劑量組均能抑制LPS誘導RAW264.7細胞產生的TNF-α，并呈一定的劑量依賴關系(P<0.05)，但外洗液低劑量組對TNF-α的抑制效果不明顯(P>0.05)；金銀花外洗液3個濃度劑量組均能抑制LPS誘導RAW264.7細胞產生的IL-6，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 0.2 μg/mL LPS與不同濃度外洗液對RAW264.7

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 外洗液對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放TNF-α、IL-6的影響(n=5)

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.4 蛋白印跡法檢測TNF-α、IL-6蛋白表達結果 0.2 μg/mL LPS刺激后，TNF-α、IL-6的蛋白表達水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。外洗液各濃度組處理后，炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白表達水平降低，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明，藥物對炎癥因子的表達具有抑制作用。見圖1。

4 討論

清熱類中藥大部分具有抗細菌、抗真菌、抗病毒等藥理作用，且多數在外用方面有較好的治療作用，具有選擇多樣性和明顯抗真菌和殺滅真菌的特點[1]。

圖1 Western blot法檢測藥物對LPS刺激的RAW264.7細胞的TNF-α、IL-6蛋白表達情況

注：1.模型組，2.正常組，3.外洗液60 μL/mL組，4.外洗液90 μL/mL組，5.外洗液120 μL/mL組。與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.05

本實驗中的細胞實驗采用小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞，用LPS誘導巨噬細胞產生炎癥因子、促進與炎癥有關的基因的表達來制造炎癥模型是現代細胞研究體系上巨噬細胞RAW264.7良好的炎癥反應模型[2]。嚴重創傷、燒傷或膿毒癥等感染或非感染因素作用于機體，引起機體失控的自我持續放大和自我破壞的全身性炎癥反應，如不及時診治易進展為多器官功能障礙綜合征[3]。巨噬細胞在保護機體免受外界病原體侵襲方面具有不可替代的作用[4]。炎癥反應是人體各類疾病的發病基礎，其分泌的細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)瀑布式地放大炎癥效應，在炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病發揮關鍵作用[5-6]。機體發生炎癥反應后，最初分泌TNF-α，其核心作用是在炎癥反應中激活其他細胞因子的級聯，直接反映炎癥反應的強度[7]。在炎癥反應初期，中性粒細胞吞噬能力減弱與IL-6的大量表達有關，可以導致組織細胞的損害，加劇炎癥介質的產生，進一步催化炎癥反應進程[8]。

MTT法簡單、快速、經濟，間接反映細胞的增殖狀態[9]。MTT結果顯示，外洗液在濃度為210 μL/mL范圍內對靜息狀態的細胞無毒害作用，可以用于后繼實驗的研究。LPS作用于RAW264.7細胞后，可以促進細胞的增殖活力，顯示細胞處于激活狀態。與模型組相比，外洗液能夠劑量依賴性地抑制細胞的增殖活性。其中60、90、120 μL/mL金銀花外洗液可基本取消LPS對細胞活力的增強作用(細胞存活率為100%±5%)，因此，選定這3個劑量濃度作為后續實驗細胞的給藥濃度。LPS刺激RAW264.7細胞后，產生早期炎癥因子(如TNF-α、IFN-γ、IL-6等)[10]。TNF-α、IL-6是最重要的促炎細胞因子，其中IL-6可以通過促進T細胞分化，進而活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導途徑導致炎癥反應加重，TNF-α則可使黏附的中性粒細胞產生呼吸爆發，促進其他多種促炎細胞因子[11]，同時，TNF-α、IL-6參與進展期關節破壞的典型的炎性細胞因子[12]。本研究結果表明，外洗液中、高劑量組均能抑制LPS誘導RAW264.7細胞產生的TNF-α、IL-6。提示外洗液的抗炎效應與抑制炎性細胞因子的產生有關。通過Western blot結果顯示，模型組中TNF-α、IL-6的蛋白含量高于正常組，表明LPS誘導RAW264.7細胞作為炎癥模型造模成功。不同濃度外洗液處理后，炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白表達水平降低，表明藥物對炎癥因子的表達具有抑制作用。

綜上所述，復方金銀花外洗液在細胞水平的主要抗炎作用與抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白表達水平有關。這為金銀花外洗液在臨床上應用于因真菌感染引起的疥癬、腳癢及足部濕疹等疾病提供了實驗依據，同時也為金銀花外洗液主要藥效成分的分析提供了理論依據。

[1] 肖冬梅,嚴斌.中草藥抗真菌應用研究[J].湖北中醫雜志,2015,37(6):70-71.

[2] Uhlmann E,Ryte A,Peyman A.Studies on the mechanism of stabilization of partially phosphorothioated oligonucleotides against nucleolytic degradation[J].Antisense Nucleic Acid Drug Dev,1997,7(4):345-349.

[3] Kaukonen KM,Bailey M,Pilcher D,et al.Systemic inflammatory response syndrome criteria in defining severe sepsis[J].N Engl J Med,2015,372(17):1629-1638.

[4] 楊琴,張志仁,姜曼,等.小鼠巨噬細胞功能極化可塑性的初步探討[J].免疫學雜志,2013,29(2):104-109.

[5] Moazzezy N,Dloomi M,Bouzari S.Effect of shiga toxin and its subunits on cytokine induction in different cell lines[J].Int J Mol Cell Med,2014,3(2):108-117.

[6] Lam D,Harris D,Qin Z.Inflammatory mediator profiling reveals immune properties of chemotactic gradients and macrophage mediator production inhibition during thioglycollate elicited peritoneal inflammation[J].Mediatons Inflamn,2013:931562.

[7] Pil HP,Hong LH,Megan RM,et al.Suppression of lipopolysaccharide stimulated tumor necrosis factor a production by adiponectin is mediated by transcriptional and post-transcriptional mechanisms[J].J Biol Chem,2008,283(40):26850-26854.

[8] Modesto R,Wenbo ZH,Dexter LL,et al.Role of IL-6 in angiotensin II-induced retinal vascular inflammation[J].Invert Ophthalmol Vis Sci,2010,51(3):54-58.

[9] 侯雪芹,張曉晶,王奇,等.體外抗AD藥物篩選中MTT、Edu和RTCA法的比較研究[J].時珍國醫國藥,2015,26(3):741-743.

[10]Pugin J,Schürer-Maly CC,Leturcq D,et al.Lipopolysaccharide activation of human endothelial and epithelial cells is mediated by lipopolysaccharide-binding protein and soluble CD14[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1993,90(7):2744-2748.

[11]Yu M,Wang H,Ding A,et al.HMGB1 signals through toll-like receptor (TLR) 4 and TLR2[J].Shock,2006,26(2):174-179.

[12]Qiu Q,Zheng Z,Chang L,et al.Toll-like receptor-mediated IRE1α activation as a therapeutic target for inflammatory arthritis[J].EMBO J,2013,32(18):2477.

Study oninvitroanti-inflammatory effect of honeysuckle lotion

HUANG Kai-yuan,WU Qun-hua,XIE Zhan-xiong,LIU Jiang-hong (Department of Pharmacy,Shenzhen Longhua New District Central Hospital,Shenzhen 518110,China)

Objective To evaluate theinvitroanti-inflammatory activities of honeysuckle lotion.Methods After incubating RAW264.7 cells with honeysuckle lotion,the cell viability was determined using an MTT assay.The levels of TNF-α and IL-6 were calculated by ELISA assay.In addition,the expression of them was confirmed by Western Blot.Results MTT assay indicated that honeysuckle lotion at 0～210 μL/mL did not affect the cell viability of RAW264.7 significantly (P>0.05),but it restrained the proliferation activity of RAW264.7 cell induced by LPS in a dose-dependent manner.The result of ELISA showed that the levels of TNF-α and IL-6 increased markedly in model group and dropped more obviously in the middle and high dose groups compared with normal group (P<0.01).Furthermore,Western blot showed the expression of TNF-α and IL-6 in model group was stronger than that of normal group (P<0.01),while after treatment with different concentrations of honeysuckle lotion,they were declined significantly (P<0.05).Conclusion The anti-inflammatory efficacy of honeysuckle lotion is mainly related to inhibiting the expression of TNF-α and IL-6.

Honeysuckle lotion;External usage;Anti-inflammatory effect

2016-03-17

深圳市龍華新區中心醫院藥劑科，深圳 518110

10.14053/j.cnki.ppcr.201610006