平菇等六種食用真菌糖蛋白的理化性質及對順鉑誘導腎細胞損傷恢復的作用

徐多多，王海洋2，孫濛濛3，韓苗苗4，趙 鑫，高其品，?

（1.長春中醫藥大學研發中心，吉林長春130117；2.吉林省藥品檢驗所中藥室，吉林長春130033；3.長春中醫藥大學藥學院，吉林長春130117；4.青島大學附屬醫院藥劑科，山東青島266555；5.重慶市渝中區精神衛生中心藥劑科，重慶400013）

平菇等六種食用真菌糖蛋白的理化性質及對順鉑誘導腎細胞損傷恢復的作用

徐多多1，王海洋2，孫濛濛3，韓苗苗4，趙 鑫5，高其品1，?

（1.長春中醫藥大學研發中心，吉林長春130117；2.吉林省藥品檢驗所中藥室，吉林長春130033；3.長春中醫藥大學藥學院，吉林長春130117；4.青島大學附屬醫院藥劑科，山東青島266555；5.重慶市渝中區精神衛生中心藥劑科，重慶400013）

采用水提醇沉法提取6種真菌中的糖蛋白，通過苯酚—硫酸法、間羥基聯苯法、BCA法測定其總糖、酸性糖和蛋白質含量，采用PMP柱前衍生化法和HPGPC法測定其單糖組成及分子量分布，采用順鉑建立受損腎細胞模型，研究6種食用真菌糖蛋白的恢復作用。結果表明，香菇糖蛋白的總糖含量最高，為38.11%，口蘑糖蛋白中蛋白質含量最高，為34.21%，各糖蛋白中酸性糖含量均較低且相差不大；6種食用真菌糖蛋白中均含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其分子量在500～20 000 u之間，在質量濃度為12.5～50μg·mL-1時6種多糖對受損腎細胞具有一定的恢復作用。理化性質測定結果表明，這6種食用真菌糖蛋白均含有較高的多糖成分，且均對順鉑誘導的腎細胞損傷具有一定的恢復能力。

真菌糖蛋白；理化性質；單糖組成；分子量分布；順鉑；恢復作用

順鉑（cis-diamminedichloroplatinum，CDDP）是一種臨床常用的化療藥物，對多種實體瘤具有較好的療效，具有抗癌譜廣、療效確切等特點，但其毒副作用大，如腎臟毒性，但相關的機理尚不十分清楚。據文獻報道，CDDP誘導的腎小管細胞凋亡在腎毒性中發揮重要作用［1］。食用真菌不僅味道鮮美，而且營養豐富，常被人們稱作健康食品。其中，食用真菌糖蛋白是一種非特異性免疫增強劑和免疫效應劑，被認為是臨床上療效較為確切的一類低毒的免疫活性物質，廣泛應用于醫療和食品中，在國際上被稱為“生物反應調節劑（BRM）”［2］。食用真菌糖蛋白具有較好的生物學活性，現代藥理研究表明，食用真菌糖蛋白具有免疫調節、抗腫瘤、降血壓血脂、抗潰瘍等作用［3］。近年來，食用真菌糖蛋白在醫藥領域的作用受到了舉世矚目的關注，并得到廣泛應用。本文以白玉菇等常見的6種食用真菌中的糖蛋白作為研究對象，采用CDDP刺激腎細胞建立受損腎細胞模型，研究其糖蛋白對受損腎細胞的恢復作用，為食用菌的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

杏鮑菇、白玉菇、口蘑、海鮮菇、平菇、香菇購自吉林農業大學菌菜基地；甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖標準品、右旋糖酐（Dextran）對照品、中性紅，均購自美國Sigma公司；MDCK細胞，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所；CDDP，MTT，美國Amresco；DMEM培養基、胎牛血清，美國Gibco公司；乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。MCO-15AC CO2恒溫培養箱，日本SANYO公司；MK-3酶標儀，美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 糖蛋白的提取

將杏鮑菇、白玉菇、口蘑、海鮮菇、平菇、香菇6種食用菌子實體切碎，晾干，加12倍量的95%乙醇室溫浸泡4 h，過濾，殘渣干燥備用。分別向各殘渣中加10倍量的水，90℃水浴溫浸，提取3次，每次3 h，合并提取液，濃縮至原體積的1/5，冷卻至室溫，緩緩滴加無水乙醇至醇濃度為80%，靜置過夜，離心，沉淀干燥，即得真菌糖蛋白［4］。

1.2.2 理化性質的測定

分別采用苯酚—硫酸法［5］、間羥基聯苯法［6］、BCA試劑盒法［7］測定所提取糖蛋白的總糖含量、酸性糖含量和蛋白質含量。

1.2.3 組成糖分析

采用PMP柱前衍生化HPLC法［8］。單糖標準品衍生物的制備：精密稱取葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖對照品各2 mg，置于具塞試管中，各加入2 mL水溶解。向其加入0.3 mol·L-1NaOH溶液1 mL，再向其加入1.2 mL 0.5 mol· L-1PMP甲醇溶液，混勻，至70℃水浴反應30 min，取出，冷卻至室溫。分別向其加入1 mL 0.3 mol·L-1HCl溶液進行中和，加入5 mL氯仿進行萃取，重復3次，取上層水相。吸取9種單糖衍生物各100μL，混勻，過0.45μm濾膜，備用。

供試品衍生物的制備：分別精密稱取6種食用真菌糖蛋白供試品5 mg于具塞試管中，加入2 mol·L-1三氟乙酸溶液，密封，至100℃烘箱中進行水解，水解8 h。取出后，吹干，加入1 mL甲醇溶液以吹盡多余的三氟乙酸。水解產物加2 mL水溶解，向其加入0.3 mol·L-1NaOH溶液1 mL，再向其加入1.2 mL 0.5 mol·L-1PMP甲醇溶液，混勻，至70℃水浴反應30 min，取出，冷卻至室溫。分別向其加入1mL 0.3mol·L-1HCl溶液進行中和，加入5 mL氯仿進行萃取，重復3次，取上層水相，得到供試品PMP衍生物，過0.45μm濾膜，備用。

色譜條件：Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱Grace Apollo C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；流動相 85% 磷酸鹽緩沖液—15%乙腈（A）；60% 磷酸鹽緩沖液—40%乙腈（B），其中，磷酸鹽緩沖液為0.025 mol·L-1KH2PO4—NaOH溶液（pH 6.8），梯度洗脫（0～10 min，B 0→8%；10～30 min，B 8%→30%；30～40 min，B 30%；40～50 min，B 30%→0）；流速為0.8 mL·min-1，柱溫為40℃，檢測波長為250 nm。

1.2.4 分子量分析

采用高效凝膠分子排阻色譜法進行測定［9］。色譜條件：TSK G-3000PWxl凝膠色譜柱、TSK guard column PWML預柱，流動相為 0.7% Na2SO4溶液（內含0.02%疊氮鈉），流速0.5 mL· min-1，柱溫 35℃，進樣量 10μL，RI-201H檢測器。

對照品溶液的制備：精密稱取Dextran T180、T1000、T5000、T12000、T25000的葡聚糖對照品，加流動相配制成每1 mL含5 mg的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，作為對照品溶液。供試品溶液的制備：取樣品適量，加入流動相配制成濃度為5 mg·mL-1的溶液，過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

1.2.5 對受損腎細胞的恢復作用

MDCK細胞培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，在37℃、5%CO2培養箱中培養，每隔2～3 d更換新鮮培養液，待細胞長滿瓶底80%時，消化、傳代。取對數生長期的細胞用于實驗。

CDDP對MDCK細胞的毒性作用：將細胞消化調整至1×105mL-1接種于96孔板中，每孔100μL，于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后棄去培養液，每孔加入不同質量濃度CDDP溶液（0、2.5、5、10、15、20μg·mL-1）100μL，放入培養箱中繼續培養，每組6個復孔。培養24 h后，分別向各孔加入10μL 5 mg·mL-1的MTT溶液，放入培養箱中孵育4 h后，棄去廢液，每孔加入150 μL DMSO溶液，振蕩均勻后于酶標儀在492 nm下測定吸光度（A）值。以不加CDDP組作為空白對照組，根據測得的A值計算細胞存活率。

食用真菌糖蛋白對MDCK細胞生長的影響：將細胞消化調整至1×105mL-1接種于96孔板中，每孔100μL，于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后棄去培養液，每孔加入不同質量濃度各糖蛋白溶液（0、1.625、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200μg·mL-1）100μL，置于培養箱中培養24 h后，采用MTT比色測定其A值，計算細胞存活率。每組5個復孔。

食用真菌糖蛋白對CDDP所致細胞毒性的保護作用：按上述方法處理細胞，實驗分為3組，分別為空白對照組、模型組（濃度為5μg·mL-1）和給藥組。空白對照組加入100μL DMEM培養液；模型組每孔分別加入5μg·mL-1CDDP溶液；給藥組在加入CDDP刺激24 h后加入質量濃度為1.625、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200μg· mL-1的糖蛋白溶液。將各組置于培養箱中繼續培養24 h，用MTT比色測定其A值，計算細胞存活率。每組5個復孔。

1.3 統計學分析

采用SPSS統計軟件進行分析，計量數據用平均值±標準差表示，用單因素方差分析組間差異，以P＜0.05具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 理化性質測定結果

由表1可知，香菇糖蛋白的總糖含量最高，為38.11%，口蘑糖蛋白的總糖含量最低，為29.86%；6種食用真菌糖蛋白的酸性糖含量均較低且相差不大；杏鮑菇糖蛋白的蛋白質含量最高，為34.21%，白玉菇糖蛋白的蛋白質含量最低，僅為12.12%。

2.2 組成糖分析結果

由表2可知，6種食用真菌糖蛋白均含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中，葡萄糖所占比例最高。除了杏鮑菇糖蛋白和平菇糖蛋白外，均含有少量果糖。

表1 六種食用真菌糖蛋白的理化性質Table 1 The physiochemical property of six edible fungus glycoprotein

表2 六種食用真菌糖蛋白的組成糖及摩爾比分析Table 2 Themonosaccharides composition and molar ratio of six edible fungus glycoprotein

2.3 分子量測定結果

HPGPC分析表明，杏鮑菇糖蛋白的分子量最大，主要分布在500～20 000 u；香菇糖蛋白的分子量最小，分布在200～9 000 u；其余4種糖蛋白分子量主要分布在500～17 000 u。

2.4 對受損腎細胞的恢復作用

2.4.1 CDDP對MDCK細胞的毒性作用

圖1 CDDP對MDCK細胞的毒性作用Fig.1 The toxic effect of CDDP on MDCK cells

由圖1可知，隨著CDDP濃度的增大，MDCK細胞的存活率降低。當CDDP濃度為5μg·mL-1時，細胞存活率約為50%，因此本文采用5μg· mL-1的 CDDP濃度考察樣品對 CDDP誘導的MDCK細胞損傷的恢復作用。

2.4.2 各食用真菌糖蛋白對MDCK細胞生長的影響

各食用真菌糖蛋白對MDCK細胞的生長影響基本相同，因此以平菇糖蛋白為例進行說明。隨著平菇糖蛋白濃度的增加，細胞的存活率呈升高趨勢。在質量濃度為100、200μg·mL-1時，與空白對照組相比具有極顯著性差異（P＜0.01）（表3）。因此，本試驗選擇3.13～50μg·mL-1作為樣品濃度。

2.4.3 各食用真菌糖蛋白對CDDP模型的恢復作用

采用CDDP建立受損腎細胞模型，研究不同濃度各食用真菌糖蛋白對其的恢復作用，結果顯示，隨著各糖蛋白濃度的增大，其存活率升高，具有一定的量效關系。當濃度在12.5～50μg· mL-1時，與模型組（CDDP）相比具有極顯著性差異（表4），以上結果說明各食用真菌糖蛋白均對受損腎細胞具有一定的保護作用。

表3 不同濃度各糖蛋白對MDCK細胞生長的影響Table 3 Effect of different concentrations of glycoprotein on the growth of MDCK cell

表4 不同濃度各糖蛋白對CDDP所致毒性的恢復作用Table 4 Effects of different concentrations of glycoprotein on CDDP induced toxicity

3 討論

自20世紀50年代以來，真菌糖蛋白作為藥物開始研究，20世紀60年代以后因其被開發為免疫促進劑而引起人們的廣泛關注。科學研究表明，真菌糖蛋白在免疫功能的調節、癌癥的診斷與治療、抗衰老及接觸機體疲勞等方面都有著十分重要的作用［10］。本文以6種常見的食用真菌作為研究對象，采用經典的水提醇沉法提取其糖蛋白，并測定其理化性質，分析其單糖組成及分子量分布，結果顯示，香菇糖蛋白的總糖含量最高，口蘑糖蛋白的總糖含量最低；杏鮑菇糖蛋白的蛋白質含量最高，白玉菇糖蛋白的蛋白質含量最低；酸性糖含量相當且均較低；各糖蛋白均含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中，葡萄糖所占的比例最高；分子量分布差異不大。

CDDP進入機體后主要經腎臟排泄，其毒副作用也以腎臟毒性最明顯，其能夠選擇性地作用于腎細胞使其受損。CDDP腎毒性的細胞毒性機理不明，有證據表明，CDDP能夠引起腎功能損傷的主要原因是與氧化應激有關的氧化性損傷。本文以CDDP刺激MDCK細胞造模，研究各食用真菌糖蛋白對腎損傷的恢復作用。結果顯示，6種食用真菌糖蛋白對腎損傷均有一定的恢復作用，但其具體作用機制還有待于進一步研究。

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（責任編輯 張 韻）

Studies on physiochem ical property and restoration on cisplatin-induced renal cell injury of the glycoprotein from six different edible fungus

XU Duo-duo1，WANG Hai-yang2，SUN Meng-meng3，HAN Miao-miao4，ZHAO Xin5，GAO Qi-pin1，?
（1.Research and Development Centre，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；2.Department of Traditional Chinese Medicine，Jilin Institute for Drug Control，Changchun 130033，China；3.College of Pharmacy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；4.Pharmacy Department，Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266555，China；5.Pharmacy Department，Mental Hygiene Center of Central District of Chongqing，Chongqing 400013，China）

The glycoprotein obtained from six different edible fungus were extracted by water and alcohol precipitation method，and phenol-sulfuric acid method，hydroxyl biphenyl method and BCA method were used to determine the content of total polysaccharides，uronic acid and protein content of six different edible fungus.The monosaccharide composition and the molecular weights distribution of each sample were determined through PMP pre-column derivatization method and HPGPC method.The renal cell injury model was established by cisplatin（CDDP）-induced Madin-Daiby Canine Kidney（MDCK）cellwas to study the restoration effect of six different edible fungus glycoprotein. The results showed that Lentinus edodes glycoprotein contained the highest content of total polysaccharides among thesix different edible fungus，which was 38.11%.Pleurotus ostreatus contained the highest content of protein，which was 34.21%，while the contents of uronic acid of each sample was low.Each of the sample contained man nose，glucose and galactose，and its molecular weight distribution ranged from 500-20 000 u.When the concentration was 12.5-50μg·mL-1，each sample had restoration effect on renal cell injury by CDDP-induced MDCK cell.The experimental results illustrated that the content of polysaccharides was rich in the six different edible fungus，and had restoration effect on the renal cell injury.

edible fungus glycoprotein；physical and chemical characteristics；monosaccharide composition；molecular weights distribution；cisplatin；restoration effect

S646.1+4

A

1004-1524（2016）09-1538-06

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.09.12

2015-10-23

徐多多（1979—），女，吉林長春人，博士，助理研究員，從事天然藥物活性研究。E-mail：czxuduoduo@163.com

?通信作者，高其品，E-mail：gaoqipin@sina.com

浙江農業學報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28（9）：1538-1543 http://www.zjnyxb.cn徐多多，王海洋，孫濛濛，等.平菇等六種食用真菌糖蛋白的理化性質及對順鉑誘導腎細胞損傷恢復的作用［J］.浙江農業學報，2016，28（9）：1538-1543.