連梅止痢中藥制劑對大腸埃希菌K88感染仔豬的療效

劉勇亮，陳 波，劉明剛，徐毓琴，戴茜茜，谷笑笑，潘康成

（四川農業大學動物醫學院動物微生態工程研究中心，四川成都611130）

連梅止痢中藥制劑對大腸埃希菌K88感染仔豬的療效

劉勇亮，陳 波，劉明剛，徐毓琴，戴茜茜，谷笑笑，潘康成?

（四川農業大學動物醫學院動物微生態工程研究中心，四川成都611130）

探討連梅止痢中藥制劑對大腸埃希菌K88感染的仔豬腹瀉的療效。72頭21日齡初始體質量平均為（4.41±0.01）kg的仔豬被分為6組：空白對照組、發病組、低劑量（0.5 mL·kg-1BW）、中劑量（1.0 mL·kg-1BW）、高劑量組（1.5 mL·kg-1BW）及抗生素組（0.2%恩諾沙星2 mL·頭-1）。給斷奶仔豬灌服一定數量的大腸埃希菌K88建立腹瀉模型，利用烏梅、黃連、訶子以及秦皮原料制備的連梅止痢中藥制劑（含生藥1 g· mL-1）對發病豬進行治療，觀察該中藥制劑對腹瀉病的療效。結果表明，該中藥制劑對仔豬大腸埃希菌腹瀉的治愈率為80%。實時定量PCR檢測結果表明，在用藥的整個階段中劑量組仔豬糞便中的大腸埃希菌K88平均數量與發病組相比顯著減少（P＜0.05），其他劑量組與發病組相比差異不顯著（P＞0.05）。從仔豬腸道形態上觀察，抗生素組和中劑量組仔豬腸道組織結構基本完整。經過生存分析發現，中劑量中藥制劑與發病組相比能顯著提高仔豬生存率（P＜0.05）。發病組生存曲線相比其他組的陡峭，而中劑量組的曲線最平緩，中藥制劑能降低仔豬的死亡率。

中藥制劑；斷奶仔豬；腹瀉模型；大腸埃希菌K88；實時定量PCR；腸道形態；生存分析

致病性大腸埃希菌尤其是產腸毒素大腸埃希菌（ETEC）是引起仔豬腹瀉的主要原因之一。ETEC可以借黏附因子黏附于腸黏膜表面幫助它們生長和繁殖，并產生熱穩定腸毒素（ST）或熱敏腸毒素（LT），引起腸道分泌增加，使大量的液體在回腸中，從而導致腹瀉［1-3］。產腸毒素大腸埃希菌K88菌毛的表達是斷奶仔豬表現腹瀉的主要原因，這將造成仔豬死亡率增加及生產性能下降等現象產生，并且在一定程度上制約養豬業的發展［4］。傳統的抗菌藥物被用作生長促進劑和胃腸感染的治療及預防［5］。目前，主要使用恩諾沙星、慶大霉素及磺胺類藥物等進行疾病的防御［6］。然而，長期使用抗生素防治疾病將產生大量的副作用，抗生素殘留在動物體內及產生耐藥菌株的現象，這不僅影響畜牧業的發展，并且將對人類的疾病治療造成深遠的影響。現在雖已研制出預防仔豬腹瀉的疫苗，但大腸埃希菌的血清型較多，變異性大及免疫程序不當等原因，應用效果不確切［7］。

中藥在國內被應用于各種疾病的治療。復方中藥制劑由多個成分組成，具有多活性等特點［8］。中藥復方制劑對仔豬腸道中大腸埃希菌具有明顯的抑制作用，可有效預防仔豬腹瀉，還可提高腸道中益生菌的數量，比如雙歧桿菌及乳桿菌等，從而可以提高仔豬的生長性能和免疫力等［9］。朱紅旗［10］利用蒼苓止瀉口服液治療仔豬腹瀉，具有較好的效果。劉靜鑫等［11］利用“腸炎康泰”（主要成分為白頭翁、黃連、秦皮等）治療仔豬腹瀉，治愈率為80.9%，比對照組高出9.1個百分點。中藥在抗菌同時具有改善和調節機體狀態的特性，此外，中草藥有毒副作用小、無殘留、不易產生耐藥性等優點。因此，利用我國特有的中醫理論和豐富的植物藥資源開發控制仔豬腹瀉制劑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

大腸埃希菌K88菌株，從重慶市豬場腹瀉仔豬糞便中分離，保存于重慶畜牧科學院獸醫研究所。

1.2 中藥制劑的制備

將烏梅、黃連、秦皮和訶子等中藥，按3∶2∶3∶2的比例混合，加水3次煎煮，加水量與藥物比例2∶1。然后長時間熬煮液體使水分減少而濃縮。濃縮后中藥制劑的原藥濃度為1 g·mL-1，藥液3 000 g離心10 min，收集上層液體，分裝，于121℃滅菌。

1.3 培養基和試劑

胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB），5% 碳酸氫鈉溶液，0.85%生理鹽水，營養肉湯等。

1.4 試驗動物及試驗設計

健康的21日齡（斷奶）的榮昌仔豬112頭，購自養殖場。其中72頭隨機分成6個組，每組2個重復，分別是空白對照組、發病組（治療期間灌服0.85%生理鹽水）、中藥低劑量組（按仔豬1 kg體質量灌服0.5 mL）、中劑量組（1 kg體質量灌服1.0 mL）、高劑量組（以1 kg體質量灌服1.5 mL）和抗生素組（恩諾沙星，1 000 mL水中添加2 g，飼喂2 mL），試驗豬舍溫度控制在（32.80±2.62）℃，濕度為（84.70±3.12）%。另外40頭隨機分成4組（3個不同細菌劑量組和對照組），用于仔豬最適細菌感染量的測定。

1.5 試驗方法

1.5.1 細菌培養

將凍干保存的大腸埃希菌K88菌株畫線接種于營養瓊脂培養基上，37℃培養24 h。將平板上生長的菌落進行革蘭氏染色鏡檢，同時根據菌落生長情況判斷是否為純菌株。

1.5.2 菌液濃度

挑取單個菌落接種于5 mL的TSB培養基中，搖床37℃培養24 h，吸取2 mL轉入100 mL TSB培養基中，繼續培養24 h。將TSB培養基轉入離心管中4℃6 000 g離心4 min，用生理鹽水洗滌濃縮菌液。然后將菌液進行10倍梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7稀釋梯度的稀釋液100μL涂布于營養瓊脂培養基，37℃培養24 h，計數。

1.5.3 仔豬腹瀉人工感染接種量的測定

將上述培養的菌液稀釋成濃度為107、108、109cfu·mL-1，將仔豬分成3組，每組10頭，并設置對照組（營養肉湯），每頭仔豬灌服4 mL菌液或營養肉湯。當仔豬被運輸到試驗豬舍時，立即進行仔豬腹瀉建立試驗，且在灌服菌液之前的10～15 min給仔豬灌服5 mL 5%碳酸氫鈉溶液，增加大腸埃希菌在胃中的存活率以及有利于培養液順利轉運到小腸部位。然后再灌服菌液，觀察仔豬的糞便及行為情況，觀察期8 d。糞便的黏稠在4個層次上進行視覺性評估和分類：0，正常；1，糊狀；2，半液體；3，液體。仔豬分數≤1的情況下，視為正常；而仔豬一般腹瀉時，糞便的黏稠在2或3的層次上。

1.5.4 中藥制劑對仔豬大腸埃希菌腹瀉的治療及評判標準

根據1.5.3節的結果選擇細菌劑量進行正式試驗，一旦觀察到仔豬發生腹瀉就立即對其進行灌服中藥制劑治療。采用一個療程，飼喂中藥5 d，每天上下午各1次，然后繼續觀察9 d。采集成功腹瀉仔豬的糞便，用于實驗室的分離鑒定。治愈表示病豬的食欲恢復正常，糞便成形，停藥后9 d內不再復發；顯效表示疾病得以緩解，食欲和糞便基本恢復正常，但停藥后又復發；無效是指病豬無明顯好轉，或病情加重，出現死亡的情況。

1.5.5 糞便中ETEC K88的檢測

糞便中的ETEC K88的細菌數量通過實時定量PCR檢測，靶基因是K88菌毛基因的一個70 bp片段［12］。糞便中細菌基因組的提取使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）。引物設計：forward primer為5′-GGTTCAGTGAAAGTCAATGCATCT-3′；reverse primer為 5′-CCCCGTCCGCAGAAGTAAC-3′。探 針：Cy5-5′-CCACCTCTCCCTAACACACCGGCAT-3′-BHQ2。引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應體系（25μL）：2.0μL DNA模板，上下游引物各1.0μL，0.5μL探針，12.5μL Premix Ex Taq DNA Polymerase，8.0μL ddH2O。反應條件：95℃預變性10min，95℃變性20 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環45次。每個糞便樣品中的ETEC K88細菌數量使用Smartcycler軟件（Cepheid，Sunnyvale，CA）對比閾值從ETEC K88標準溶液繪制的標準曲線進行評估。

1.5.6 仔豬腸道形態

在用藥結束之后，采集仔豬十二指腸，腸道樣品的準備按照文獻［13］進行。將固定的樣品石蠟包埋，然后切片、貼片、脫蠟、復水、蘇木精伊紅（H.E.）染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片，在Nikon數碼顯微鏡下觀察并照相。

1.5.7 生存分析

為了了解大腸埃希菌腹瀉疾病的預后和評價中藥制劑治療的效果，對各組治療后的仔豬進行觀察。首先，針對存活仔豬的生存函數由Kaplan-Meier方法進行評估，風險函數模型為：h（t）= h0（t）exp｛X1′β1+X2′（t）β2+Z′U+W′（t）q｝，公式中h（t）指的是在t（仔豬的日齡）時間內的死亡風險，h0（t）是基線風險函數，β1和β2是對于一系列獨立的（即與時間無關）因素固定回歸系數的未知向量，X1′和X2′（t）是依賴時間因素指標變化的向量，U是對于隨機因素的一個未知的回歸系數向量，Z′是生存繁殖因素指標變化的一個向量，q是由于隨時間變化的隨機因素回歸系數的一個未知向量，W′（t）是隨時間變化的隨機因素指標變化的一個向量。

對用該中藥治療后的仔豬進行30 d的觀察，并記錄仔豬生存情況。然后，通過SPSS進行統計分析各組仔豬的生存概率并作圖。

1.6 統計分析

試驗中結果使用單因素方差進行統計學分析（SAS，Cary，NC），鄧肯氏多重檢測用于比較各組之間的差異，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 腹瀉仔豬模型最適細菌感染量的測定

由表1可見，在試驗中采用4.0×108cfu的細菌劑量能使仔豬100%發生腹瀉，雖然4.0× 109cfu的細菌劑量也能使得仔豬全部發生腹瀉，但是仔豬的死亡率較高，而4.0×107cfu的細菌劑量只能使60%的仔豬發生腹瀉，無死亡現象，對照組中有1頭仔豬發生自然腹瀉。腹瀉仔豬的體溫無明顯的變化，精神抑郁，食欲降低或不采食，排出灰白色的粥樣腥臭味的糞便。死亡仔豬外觀消瘦，皮膚彈性差，后軀多被糞便污染。

表1 試驗中時間進程、腹瀉率及死亡率結果Table 1 The statistical results of time course and diarrhea rate and mortality in the test

2.2 中藥制劑對斷奶仔豬腹瀉的療效

根據臨床觀察，分別統計出中藥制劑對各組腹瀉的斷奶仔豬的治療情況，統計結果見表2。

2.3 實時定量PCR檢測糞便中K88細菌

實時定量PCR檢測結果見表3，在用藥階段中劑量組仔豬糞便中的大腸埃希菌K88平均水平與發病組相比差異顯著（P＜0.05），前者與低劑量和高劑量之間無差異（P＞0.05）。

2.4 中藥制劑對仔豬腸道形態的影響

從組織切片顯微結構觀察顯示（圖1），空白對照組仔豬腸道結構組織完整，絨毛排列整齊，腸道輪廓清晰；人工發病組仔豬腸道黏膜層受損，甚至缺失，腸絨毛受到損傷，嚴重斷裂、脫落，腸腺萎縮、變性；高劑量組仔豬腸道黏膜層充血，輕微水腫，有少量炎癥細胞浸潤，腸道絨毛病變減輕，得到一定的緩解；抗生素組和中劑量組仔豬腸道組織結構基本完整，黏膜下層有少量炎癥細胞，絨毛上存在部分斷痕；低劑量組仔豬腸道黏膜層基本完整，可看到完整獨立的結構，杯狀細胞數減少，病變得到及時緩解。

表2 中藥制劑對腹瀉斷奶仔豬的臨床治療統計結果Table 2 The results of treatment of traditional Chinese medicine preparation on diarrhea of weaned piglets

表3 中藥制劑對用ETEC K88建立的斷奶仔豬腹瀉的效果Table 3 Effects of Chinese herbal medicine on clinical signs of weaning pigs challenged with ETEC K88

圖1 中藥制劑對仔豬腸道形態的影響Fig.1 Effect of preparation of Chinese herbs on intestinal morphology in piglets

2.5 對仔豬生存率的影響

為了比較不同劑量對治療仔豬大腸埃希菌腹瀉的療效，在試驗初期到試驗觀察結束為止。利用Kaplan-meier分析在觀察時間段內各組仔豬的生存過程，可以統計出各組仔豬在不同處理下的生存時間評估。中位生存期越長，表示疾病的預后越好；中位生存期越短，預后越差。由表4可見，只有發病組和高劑量組的中位生存時間可評估，高劑量組的評估值高于發病組，但差別不大。其他組中位生存時間不存在的原因是組別對應的生存概率大于0.5，同時無法計算置信區間。

表4 生存時間評估Table 4 Mean and median for survival time

通過各組之間成對比較，可有效體現用藥對仔豬生存率的影響。由表5可見，與對照組相比，中劑量中藥和抗生素顯著提高仔豬生存率（P＜0.05），而低劑量和高劑量中藥對提高仔豬生存率作用不顯著（P＞0.05），中藥制劑各劑量之間相比差異不顯著（P＞0.05）。

該試驗的生存曲線以觀察時間為橫坐標，以生存率為縱軸建立。從圖2可見，發病組的生存曲線最陡峭，表明具有較低的生存率或較短的生存期；中劑量組的生存曲線較平緩，表明具有較高的生存率或較長的生存期；低劑量和高劑量的生存曲線的陡峭程度介于兩者之間，以中劑量飼喂斷奶腹瀉仔豬相比更有利于提高仔豬的生存率。

表5 組間成對比較Table 5 Pairwise Comparisons of each group

圖2 不同中藥制劑劑量對治療仔豬的生存曲線Fig.2 Effect of different traditional Chinese medicine preparation dose on the survival curves of piglets

3 討論

在現代化集約豬場主要采取多種抗菌藥物治療仔豬大腸埃希菌腹瀉。抗菌藥物的長期使用會造成大腸埃希菌的耐藥性，而且抗菌藥物只能對菌群有一定的抑制作用，但對腸毒素大腸埃希菌產生的腸毒素無效果。另外，耐藥菌株包含的耐藥基因，可通過食物和環境傳染給人類［14］。所以替代抗菌藥物的其他物質來治療仔豬腹瀉顯得尤為重要。

在此研究中，為了增加模型菌株的成活率，在灌入致病性大腸埃希菌菌液之前的10～15 min口服5 mL 5%的碳酸氫鈉溶液以中和仔豬胃酸［15-16］。在仔豬腹瀉模型建立試驗中，用4.0× 107，4.0×108和4.0×109cfu的大腸埃希菌劑量去感染仔豬，4.0×108cfu的細菌劑量能夠使仔豬100%腹瀉，而且腹瀉從1～2 d開始，平均3 d左右，與Sarmiento等［17］報到的基本上相似，而4.0×109cfu的細菌劑量雖也造成全部腹瀉，但具有較高的死亡率，影響正式試驗的研究。腹瀉仔豬精神抑郁，動作緩慢，出現厭食或不采食的臨床特征，試驗中仔豬的死亡可能與大腸埃希菌大量繁殖和釋放毒素有關。

本試驗主要是用烏梅、黃連、訶子和秦皮制備的中藥制劑來觀察對仔豬大腸埃希菌腹瀉的療效。從結果上看，該中藥制劑對仔豬腹瀉有一定的治療作用，中藥制劑對仔豬大腸埃希菌腹瀉的治愈率最高為80%，且降低仔豬的死亡率，主要原因是所制備的中藥制劑具有清熱解毒的功效，研究報道秦皮、黃連、訶子和烏梅均具有抗菌消炎的作用［18-21］。另外，烏梅及訶子具有澀腸止瀉和生津止渴的效果。該中藥制劑的作用機理還有待進一步的研究。

生存分析技術［22-23］的發展不僅給動物育種以及仔豬斷奶前仔豬的成活提供新的方法，而且能夠被運用到疾病預后的判斷。本文對仔豬的生存分析進行評判，主要是通過Kaplan-Meier方法，因Kaplan-Meier過程主要用于小樣本發生事件的記錄，可比較在不同研究水平下各組之間的生存事件有無差異性。在對評估中藥制劑對提高仔豬生存率上，中劑量的中藥制劑與發病組相比差異顯著（P＜0.05），從每組仔豬的生存曲線上看，發病組的曲線下降速度較快，死亡率較大，而中劑量的中藥制劑對仔豬有一定的作用，很大程度降低了仔豬的死亡率。通過上述試驗說明中劑量的中藥制劑對仔豬大腸埃希菌腹瀉的治愈率為80%，且能有效降低仔豬的死亡率。

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（責任編輯 盧福莊）

Effect of Lianmei dysentery Chinese herbal preparation on weaned piglet diarrhea by an Escherichia coli（K88）experimental infection

LIU Yong-liang，CHEN Bo，LIU Ming-gang，XU Yu-qin，DAIXi-xi，GU Xiao-xiao，PAN Kang-cheng?
（Research Center of Animal Microecology，College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu，611130，China）

The present study was performed to investigate the treatment effect of Lianmei dysentery Chinese herbal preparation on diarrhea in weaned piglets challenged with Escherichia coli K88.Seventy-two piglets（21 d old，and initial BW of4.41±0.01 kg）were assigned to 6 groups，which were blank control group，diarrhea model group，low dose group（0.5 m L·kg-1BW），medium dose group（1.0 mL·kg-1BW），high dose group（1.5 mL·kg-1BW）and antibiotics group（0.2%enrofloxacin 2 mL·pig-1）.Piglets were infected a certain amount of Escherichia coli（K88）by oral gavage，except the blank control group，and then treated with the low，medium and high dose of Chinese herbal medicine（containing crude drug 1 g·mL-1）that was made from Druk Plum（Wumei），Coptis chinensis Franch（Huanglian），Terminalia chebula Retz（Hezi），Cortex Fraxini（Qinpi）in the test groups or with enroflox-acin in the antibiotic group.The curative effect of traditional Chinese medicine preparation for diarrheal illness was observed.The results showed that the cure rate with the traditional Chinese medicine preparation for diarrhea in piglets was80%.Measured by quantitative real-time PCR，the mean level of ETEC K88 in feces of medium dose group and the antibiotic group was significantly different from that of the diarrhea model group（P＜0.05）in the whole treatment duration，the other two groups had no difference from the diarrhea model group（P＞0.05）.From the observation of intestinal morphology of piglets，the antibiotic group and the medium dose group had the basic integrity of the intestinal tissue structure.Based on the survival analysis for piglets of each group，the medium dose group significantly increased the survival rate of piglets compared with the other groups（P＜0.05）.The survival curves of diarrhea model group was steeper compared with the other groups，which indicated that traditional Chinese medicine reduced the mortality of piglets.

Chinese herbal preparation；weaned piglet；diarrhea model；Escherichia coli K88；quantitative real-time PCR；intestinal morphology；survival analysis

S853.73

A

1004-1524（2016）09-1493-08

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.09.06

2015-05-08

“教育部長江學者和創新團隊發展計劃”創新團隊資助項目（IRT0848）；四川農業大學創新性實驗計劃和科研興趣培養計劃（1310626013）

劉勇亮（1990—），男，四川廣安人，碩士研究生，研究方向為動物微生態。E-mail：lyliang19908@126.com

?通信作者，潘康成，E-mail：pankangcheng71@126.com

浙江農業學報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28（9）：1493-1500 http://www.zjnyxb.cn劉勇亮，陳波，劉明剛，等.連梅止痢中藥制劑對大腸埃希菌K88感染仔豬的療效［J］.浙江農業學報，2016，28（9）：1493 -1500.