肥胖對(duì)非致死性肺炎小鼠血液生理指標(biāo)、4種細(xì)胞因子和免疫器官指數(shù)的影響

萬濤梅，袁貴強(qiáng)，王正義，賈義平，任 毅，左之才

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川溫江611130）

肥胖對(duì)非致死性肺炎小鼠血液生理指標(biāo)、4種細(xì)胞因子和免疫器官指數(shù)的影響

萬濤梅，袁貴強(qiáng)，王正義，賈義平，任 毅，左之才?

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川溫江611130）

為探討肥胖對(duì)非致死性肺炎全身性免疫反應(yīng)的影響，將高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠分為Ⅰ、Ⅱ組，非肥胖小鼠分為Ⅲ、Ⅳ組，Ⅰ、Ⅲ組滴鼻40μL含4×109cfu大腸埃希菌菌液，Ⅱ、Ⅳ組滴鼻40μL生理鹽水，于感染后2、6、12、24、48、72、96 h檢測(cè)各組小鼠免疫器官指數(shù)、血液生理指標(biāo)、血清細(xì)胞因子。結(jié)果顯示，高脂飼喂8周，Ⅱ組體質(zhì)量，血液WBC、GRA、MID數(shù)量，血清TNF-α、IL-6、IL-10、抵抗素濃度均顯著高于Ⅳ組，脾質(zhì)量及指數(shù)、胸腺質(zhì)量及指數(shù)顯著低于Ⅳ組（P＜0.05）。感染后，Ⅰ組脾指數(shù)2～72 h顯著高于Ⅱ組，2、6、48、72、96 h顯著高于Ⅲ組（P＜0.05），胸腺指數(shù)6、12 h顯著低于Ⅱ組，72、96 h顯著低于Ⅲ組（P＜0.05）。Ⅰ、Ⅲ組血液WBC、GRA、MID在感染后先升高后降低最后恢復(fù)至對(duì)照組水平，24 h時(shí)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)期間Ⅰ組WBC、GRA、MID均顯著高于Ⅲ組（P＜0.05）。感染后，Ⅰ、Ⅲ組血清TNF-α、IL-6、IL-10和抵抗素濃度于2 h顯著升高（P＜0.05），除Ⅲ組抵抗素外，均維持高濃度至48 h，Ⅰ組4種細(xì)胞因子2 h和6 h顯著高于Ⅲ組，96 h顯著低于Ⅲ組（P＜0.05）。表明高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖對(duì)全身性炎癥反應(yīng)的敏感性提高，增強(qiáng)了免疫反應(yīng)。

肥胖；非致死性肺炎；血液生理指標(biāo)；細(xì)胞因子；臟器指數(shù)

肥胖是由多因素引起的體內(nèi)脂肪堆積過多、脂質(zhì)異位沉積的一種慢性代謝性疾病，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們生活水平的提高，肥胖已成為全球關(guān)注的健康問題。肥胖對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響，不僅體現(xiàn)在機(jī)械性地阻礙了膈肌和呼吸道平滑肌的運(yùn)動(dòng)，使胸腔及肺順應(yīng)性下降，肺容量受到限制，通氣功能受損［1］，還改變了免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子及免疫器官的數(shù)量與功能［2-3］，從而干預(yù)了肺臟對(duì)病原微生物的敏感性及機(jī)體的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖使肺部處于一種高度促炎狀態(tài)，增強(qiáng)了機(jī)體的防御能力［4-5］，同時(shí)提高了肺炎感染的風(fēng)險(xiǎn)和死亡率［6-7］，這可能與肥胖影響了肺部感染引起的全身性炎癥反應(yīng)強(qiáng)度和免疫應(yīng)答水平有關(guān)。但國內(nèi)外在探討肥胖對(duì)機(jī)體防御能力的影響時(shí)，大多集中于對(duì)受損靶器官的分析，對(duì)感染機(jī)體全身炎癥的研究甚少。本試驗(yàn)通過檢測(cè)肥胖小鼠血液生理指標(biāo)、部分細(xì)胞因子及免疫器官指數(shù)在感染非致死性肺炎過程中的變化，旨在探討肥胖對(duì)非致死性肺炎所致全身性炎癥反應(yīng)及免疫水平的影響，為研究肥胖干預(yù)肺炎患者預(yù)后的機(jī)制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）菌株從患水腫病竹鼠腹腔積液中分離，經(jīng)過生化性質(zhì)鑒定、血清型鑒定和16S rDNA測(cè)序鑒定，保存于本實(shí)驗(yàn)室［8］。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明雄鼠220只，3～4周齡，體質(zhì)量14～16 g，購于成都達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司。

1.3 小鼠肥胖模型的建立

隨機(jī)選取100只飼喂RD（RM組），120只飼喂HD（HM組）（配方見表1），連續(xù)飼喂8周，試驗(yàn)期間小鼠自由攝食及飲水，每周稱量一次體重。根據(jù)人類肥胖標(biāo)準(zhǔn)，將肥胖度大于20%視為肥胖模型建立成功，肥胖度=（試驗(yàn)組實(shí)際體質(zhì)量-對(duì)照組平均體質(zhì)量）/對(duì)照組平均體質(zhì)量×100%［9］。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of the basic diet

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

從HM組中選取造模成功的小鼠84只，平均分為Ⅰ、Ⅱ組，從RM組中同樣選取狀況接近的小鼠84只，平均分為Ⅲ、Ⅳ組，其中Ⅰ、Ⅲ試驗(yàn)組鼻內(nèi)滴注40μL含4×109cfu的大腸埃希菌液，構(gòu)建非致死性肺炎模型，Ⅱ、Ⅳ對(duì)照組鼻內(nèi)滴注40μL生理鹽水，連續(xù)觀察4 d。試驗(yàn)期間各組小鼠按常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由攝食和飲水。

1.5 樣本采集與指標(biāo)檢測(cè)

于感染后2、6、12、24、48、72、96 h，每組隨機(jī)選取6只小鼠，摘除眼球采血，一部分用全自動(dòng)血球分析儀（ABACUS Junior Vet，瑞士）檢測(cè)白細(xì)胞（WBC）、中性粒細(xì)胞（GRA）、淋巴細(xì)胞（LYM）和中間細(xì)胞（MID），一部分分離血清用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6、IL-10和抵抗素濃度。采集胸腺、脾臟稱量，計(jì)算免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=免疫器官質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用“平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用 SPSS 15.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肥胖相關(guān)指標(biāo)的比較

高脂飼喂8周后，HM組小鼠體質(zhì)量、附睪脂肪量、Lee's指數(shù)、血糖、血清胰島素均顯著高于（P＜0.05）NM組（表 2），表明肥胖模型構(gòu)建成功。

表2 小鼠肥胖相關(guān)指標(biāo)比較Table 2 Comparison of obesity related indexes in mice

2.2 臨床癥狀變化

Ⅱ、Ⅳ組小鼠滴鼻生理鹽水后均精神良好，反應(yīng)靈敏，飲、食欲正常。Ⅰ、Ⅲ組小鼠在感染后出現(xiàn)蜷縮，扎堆，精神抑郁，呼吸急促，典型腹式呼吸，眼分泌物增加，食欲減少或廢絕等現(xiàn)象，但各組均無死亡。

2.3 免疫器官質(zhì)量及指數(shù)的變化

由表3可見，高脂飼喂8周，Ⅱ組體質(zhì)量顯著高于Ⅳ組，脾臟、胸腺質(zhì)量及其指數(shù)顯著低于Ⅳ組（P＜0.05），表明營養(yǎng)性肥胖能引起脾臟和胸腺萎縮。

滴鼻大腸埃希菌后，Ⅰ、Ⅲ組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），至72 h時(shí)降到最低，脾質(zhì)量及指數(shù)先升高后降低，胸腺質(zhì)量及指數(shù)先降低后升高趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，Ⅰ組脾質(zhì)量在2～72 h、其指數(shù)在整個(gè)試驗(yàn)期間均顯著升高（P＜0.05），胸腺質(zhì)量在6～96 h、其指數(shù)在72、96 h顯著降低（P＜0.05），Ⅲ組脾質(zhì)量及指數(shù)在6～24 h顯著升高（P＜0.05），96 h顯著降低（P＜0.05），胸腺質(zhì)量在整個(gè)試驗(yàn)期間，其指數(shù)在2、24、48、72 h均顯著降低（P＜0.05）。與III組比較，Ⅰ組脾質(zhì)量在2、6、48、72、96 h時(shí)顯著升高（P＜0.05），胸腺質(zhì)量在6、12 h時(shí)極顯著降低（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 血液生理指標(biāo)的變化

與Ⅳ組比較，Ⅱ組血液WBC、GRA、MID均顯著升高（P＜0.05），LYM無顯著性差異（P＞0.05）。表明營養(yǎng)性肥胖能提高循環(huán)血液中的白細(xì)胞總數(shù)，以中性粒細(xì)胞和中間細(xì)胞為主。

由表4可知，Ⅰ、Ⅲ組外周血液WBC、GRA、MID、LYM在感染后逐漸升高，至12 h達(dá)到峰值，隨后在24 h時(shí)迅速降至低谷，后又逐漸升高。與對(duì)照組比較，Ⅰ組WBC、GRA、MID在2、6、72 h顯著升高（P＜0.05），在24、96 h時(shí)顯著降低（P＜0.05），LYM在各時(shí)間點(diǎn)均無顯著性變化（P＞0.05），Ⅲ組WBC、GRA、MID在6、72 h顯著

升高（P＜0.05），在24 h顯著降低（P＜0.05），LYM在12、24 h顯著降低（P＜0.05）。與Ⅲ組比較，Ⅰ組WBC、GRA、MID在2、6、24、72 h顯著升高（P＜0.05），LYM數(shù)量在2、48、72 h時(shí)顯著升高（P＜0.05）。

表3 非致死性肺炎小鼠免疫器官質(zhì)量的變化Table 3 Changes of viscera index during nonfatal pneumonia

表4 小鼠肺部感染大腸埃希菌后血液生理指標(biāo)的變化Table 4 Variation of blood physiological index during E.coli infection109·L-1

2.5 血清中細(xì)胞因子含量的變化

由表5可知，與Ⅳ組比較，Ⅱ組血清TNF-α、IL-6、抵抗素濃度均顯著升高（P＜0.05），IL-10明顯升高但差異未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。結(jié)果表明，營養(yǎng)性肥胖能誘導(dǎo)促炎因子（TNF-α、IL-6、抵抗素）的分泌，對(duì)抗炎因子（IL-10）的影響較弱。

大腸埃希菌感染后，Ⅰ、Ⅲ組血清TNF-α、IL-6、IL-10、抵抗素濃度迅速升高，且維持在較高水平至48 h，隨后逐漸降低。與對(duì)照組比較，Ⅰ組TNF-α在整個(gè)試驗(yàn)期間、IL-6和IL-10、抵抗素在2～48 h期間均顯著升高（P＜0.05），至96 h，IL-10顯著降低（P＜0.05），IL-6和抵抗素雖然也降低，但差異未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。Ⅲ組TNF-α、IL-6和抵抗素在整個(gè)試驗(yàn)期間、IL-10在2～72 h期間均顯著升高（P＜0.05）。與非肥胖小鼠Ⅲ組比較，Ⅰ組TNF-α在2、72和96 h顯著升高（P＜0.05），IL-6和IL-10在2、6 h顯著升高（P＜0.05），IL-6在 12、96 h顯著降低（P＜0.05），IL-10在96 h顯著降低（P＜0.05），抵抗素在24、48 h顯著升高，在96 h顯著降低（P＜0.05）。

表5 小鼠感染大腸埃希菌后血清中細(xì)胞因子的變化Table 5 Changes of cytokines in the serum during E.coli infection

3 討論

3.1 肥胖對(duì)非致死性肺炎小鼠免疫器官指數(shù)的影響

早期研究發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠脾臟和胸腺質(zhì)量明顯降低，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的產(chǎn)量減少，提示肥胖誘導(dǎo)了免疫器官發(fā)生萎縮［10-11］。本試驗(yàn)中，高脂飼喂8周，成功建立小鼠肥胖模型，與非肥胖比較，肥胖組脾臟和胸腺質(zhì)量及指數(shù)顯著降低，與Kimura等［12］和Trufakin等［3］的研究一致，表明肥胖能抑制機(jī)體免疫器官的生長發(fā)育，損害細(xì)胞免疫水平，影響機(jī)體的非特異性免疫功能。

胸腺在感染過程中最易受到侵襲，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加，淋巴細(xì)胞生成急劇減少，這是病原微生物破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)的主動(dòng)進(jìn)攻，也是機(jī)體抵御損傷的T細(xì)胞過度分泌和中樞免疫器官對(duì)病原體產(chǎn)生耐受的積極防御，胸腺過早萎縮是感染機(jī)體存在的一種普遍現(xiàn)象［13-15］。本試驗(yàn)小鼠感染大腸埃希菌后胸腺發(fā)生明顯萎縮，且非肥胖組萎縮速度更快，幅度更大，這可能與感染使能量消耗增加，機(jī)體處于能量負(fù)平衡、營養(yǎng)失調(diào)的狀態(tài)有關(guān)［16-17］。機(jī)體發(fā)生感染時(shí)，脾臟一方面通過免疫細(xì)胞的快速增殖清除衰老的細(xì)胞和病原，另一方面通過造血功能彌補(bǔ)紅細(xì)胞的損失，因此會(huì)出現(xiàn)暫時(shí)腫大的現(xiàn)象，這也是機(jī)體的一種主動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)［18-19］。本試驗(yàn)小鼠感染大腸埃希菌后，脾質(zhì)量及指數(shù)顯著增加，可能是脾臟主要通過增加自身體積的方式達(dá)到抗感染的效果。試驗(yàn)期間，肥胖組脾質(zhì)量及指數(shù)升高幅度顯著大于非肥胖組，這可能與肥胖引起了脾臟一定程度的萎縮，脾功能受損，為清除等量病原，迅速提高自身質(zhì)量，以增強(qiáng)免疫功能有關(guān)，但具體原因尚不明確。

3.2 肥胖對(duì)非致死性肺炎小鼠血液中白細(xì)胞的影響

大量文獻(xiàn)報(bào)道，肥胖可提高循環(huán)系統(tǒng)白細(xì)胞總數(shù)［20-22］，但也有研究稱肥胖對(duì)血液中白細(xì)胞數(shù)量無顯著影響［23］，這可能與入選試驗(yàn)動(dòng)物年齡有關(guān)［24-25］。本試驗(yàn)中11～12周的肥胖小鼠血液中WBC顯著增加，且以中性粒細(xì)胞和中間細(xì)胞為主，與Sch?fer等［24］的結(jié)論一致，但淋巴細(xì)胞數(shù)量無明顯變化，與 Kim等［26］的研究結(jié)果一致。

循環(huán)血液中先天性免疫細(xì)胞為在機(jī)體獲得性免疫啟動(dòng)之前防止病原微生物在局部組織的增殖擴(kuò)散，通常被募集到局部感染部位，導(dǎo)致循環(huán)血液中白細(xì)胞數(shù)量減少，但當(dāng)機(jī)體獲得性免疫啟動(dòng)后，外周白細(xì)胞又逐漸上升，恢復(fù)先天免疫功能［27］。本試驗(yàn)小鼠感染非致死性肺炎后，血液中WBC、GRA、MID數(shù)量顯著升高，且肥胖小鼠的升高幅度明顯大于非肥胖小鼠，與Peter等［28］的研究結(jié)果一致，表明肥胖小鼠對(duì)細(xì)菌感染具有更高的敏感性，對(duì)病原菌的侵襲能做出更強(qiáng)烈的反應(yīng)。但隨著炎癥的進(jìn)行，至24 h，血液中WBC、GRA、MID數(shù)量均迅速下降至最低水平，隨后又逐漸升高，最后恢復(fù)到基線水平，這一現(xiàn)象與奶牛感染無乳支原體后循環(huán)血液中白細(xì)胞數(shù)減少而靶器官白細(xì)胞浸潤增加相似［27］。

3.3 肥胖對(duì)非致死性肺炎小鼠血清細(xì)胞因子的影響

肥胖能激活外周免疫細(xì)胞，改變其功能，提高循環(huán)血液中TNF-α、IL-6、抵抗素等炎癥調(diào)節(jié)因子水平［29-30］，使機(jī)體處于一種慢性炎癥狀態(tài)。本試驗(yàn)營養(yǎng)性肥胖小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10和抵抗素濃度明顯高于非肥胖小鼠，與肥胖人群和肥胖動(dòng)物的模式一致［31-33］，表明肥胖能促進(jìn)炎癥介質(zhì)的表達(dá)與分泌，提高循環(huán)系統(tǒng)細(xì)胞因子的濃度，影響機(jī)體對(duì)病原刺激的敏感性。

研究發(fā)現(xiàn)，肺炎早期肥胖小鼠血清中IL-6、MCP-1等促炎因子水平明顯高于非肥胖小鼠，但在后期卻顯著下降，低于非肥胖小鼠［28］，提示在肺損傷過程中肥胖機(jī)體有更高的炎癥因子水平，對(duì)感染的敏感性提高［34］，同時(shí)降低了后期炎癥因子濃度，有可能促進(jìn)了機(jī)體的修復(fù)。本試驗(yàn)小鼠感染非致死性肺炎后，血清TNF-α和IL-6濃度迅速升高，肥胖較非肥胖升高幅度更大，更快達(dá)到峰值。少量IL-10分泌能抑制單核/巨噬細(xì)胞的活性及TNF-α等促炎因子的釋放，使 CD4+Th1表型向Th2轉(zhuǎn)變，緩解肺臟炎癥損傷，尤其是肥胖感染患者［35］。本試驗(yàn)小鼠感染后，血清IL-10急劇上升，持續(xù)高濃度至48 h，與已有結(jié)果一致［36-37］。抵抗素是由脂肪組織特異性分泌的一種新型促炎因子，能調(diào)節(jié)炎癥進(jìn)程［38］，本試驗(yàn)小鼠感染肺炎后，血清抵抗素濃度迅速升高，在6 h達(dá)到峰值，其中肥胖組持續(xù)高濃度至48 h，隨后逐漸降低，與胡建慧等［39］的報(bào)道一致，而非肥胖組在24、48 h時(shí)急劇下降，這可能與感染組織的纖維化水平有關(guān)［40］。血清中TNF-α、IL-6、IL-10和抵抗素水平能評(píng)判肺臟感染的嚴(yán)重程度［41-42］，試驗(yàn)中肥胖組4種因子濃度在感染后96 h時(shí)均顯著低于非肥胖組，表明肥胖可能促進(jìn)了炎癥的消散和機(jī)體的恢復(fù)。

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（責(zé)任編輯 盧福莊）

Effects of obesity on blood physiological parameters，four cytokines and immune organs index in response to nonfatal pneumonia in m ice

WAN Tao-mei，YUAN Gui-qiang，WANG Zheng-yi，JIA Yi-ping，REN Yi，ZUO Zhi-cai?
（Key Laboratory of Animal Disease and Human Health ofSichuan Province/Key Laboratory of Environmental Hazard and Animal Disease of Sichuan Province/College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Wenjiang 611130，China）

To investigate the impact of obesity on systemic immune responses of nonfatal pneumonia，high-fat induced obese mice were divided into group Ⅰ，Ⅱ，and the mice fed with standard diet were divided into group Ⅲ，Ⅳ.Group Ⅰ，Ⅲ were infused intranasally by 40μL bacteria solution containing 4×109cfu Escherichia coli（E.coli），and group Ⅱ，Ⅳ were given the same dose of saline.The blood physiological parameters，cytokines in serum and indexes of immune organs of all groups were detected at2，6，12，24，48，72 and 96 h post-infection.As a result，fed with high-fat diet for 8 weeks，the mice had greater WBC，GRA，MID counts，higher concentrations of TNF-α，IL-6，IL-10 and resist in，and lower indexes of spleen and thymus.After infection，indexes of spleen ingroup Ⅰ were higher than those in group Ⅱ during 2 to 72 h，and in group Ⅲ at2，6，48，72 and 96.Indexes of thymus in groups Ⅰ were lower than those in group Ⅱ at6，12 h and in group Ⅲ at72，96 h post-infection.During infection，WBC，GRA，MID counts increased firstly，then decreased，finally decreased to the controls in groupⅠ，Ⅲ，and were both lower than those in control groups at 24 h post-infection.In the experimental period，WBC，GRA，MID counts in group Ⅰ were higher than those in groupⅢ.The concentrations of TNF-α，IL-6，IL-10 and resistin elevated at2 h post-infection，and maintained high concentrations to 48 h post-infection except resistin in group Ⅲ.The four cytokines in group Ⅰ were higher than those in group Ⅲ at2，6 h，and lower at96 h post-infection.The results revealed that experimental mice presented systemic inflammatory responses during nonfatal pneumonia，and obesity enhanced the immune responses to inflammation to promote the abreaction of inflammation.

obesity；nonfatal pneumonia；blood physiological parameters；cytokine；immune organs index

R392.32

A

1004-1524（2016）09-1485-08

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.09.05

2015-12-03

四川省科技廳支撐項(xiàng)目（2013NZ0032）

萬濤梅（1990—），女，四川南充人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹形鳙F醫(yī)與臨床。E-mail：408914590@qq.com

?通信作者，左之才，E-mail：zzcjl@126.com

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28（9）：1485-1492 http://www.zjnyxb.cn萬濤梅，袁貴強(qiáng)，王正義，等.肥胖對(duì)非致死性肺炎小鼠血液生理指標(biāo)、4種細(xì)胞因子和免疫器官指數(shù)的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28（9）：1485-1492.