卵胞漿內單精子顯微注射完全受精失敗的原因和處理對策

黃瑩 綜述 胡少飛 審校

南寧市婦幼保健院生殖醫學中心，廣西 南寧 530011

輔助生殖技術發展至今，常規體外受精(in vitrofertilization，IVF)和卵胞漿內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)正常受精率的平均值分別是66.00%和73.83%[1]，但是所有的卵均未能受精的情況仍然存在，稱之為完全受精失敗(total fertilization failure，TFF)。TFF在IVF周期的發生率是5%~10%[2]，IVF-TFF發生后受精方式則采用ICSI，但在ICSI助孕周期，TFF發生率也有1%~4%[3]。在試管嬰兒助孕周期中出現TFF，對于患者來說意味著無可利用的胚胎。如果一對夫婦經歷了一次TFF，那么再助孕周期TFF的重復出現率接近30%[4]。本文就卵胞漿內單精子顯微注射完全受精失敗可能的原因和臨床對策進行綜述。

1卵胞漿內單精子顯微注射完全受精失敗的原因

1.1 卵母細胞激活失敗(oocyte activation failure，OAF)卵母細胞激活失敗是指精子注射進卵母細胞胞漿后卵母細胞激活失敗，也被認為是ICSI完全受精失敗的重要原因[5-6]。大多數研究認為導致OAF主要精子因素(sperm related factors)和卵子因素(oocyte related factors)兩種類型[7-9]，精子因素主要有精子特異性蛋白PLCε異常表達、精子魚精蛋白缺陷(protamine)、精子的中性粒(centrosome)和蛋白酶體(proteasomes)異常；而卵子因素有MII卵母細胞的成熟異常、染色體異常、細胞結構異常、基因表達異常和紡錘體異常等問題，但卵因素導致OAF的分子機制并不清楚。

1.2 卵母細胞的質量 在ICSI治療周期中，受精過程中最重要的因素通常被認為是卵母細胞的質量。35歲及以上的女性經常存在卵母細胞質量下降。KULIEV等[10]研究人員發現>37歲患者的卵母細胞和胚胎中有超過50%存在染色體的非整倍體。卵巢在高劑量Gn的刺激下出現卵母細胞代謝紊亂、三磷酸腺苷含量降低、染色體轉錄行為異常、細胞質與細胞核的成熟不同步，從而導致完全受精失敗[11]。獲取適當數目成熟卵母細胞也和卵母細胞的質量密切相關，HAAF等[12]的研究發現在相同年齡組患者中，獲卵數大于10枚組的卵母細胞染色體異常發生率明顯增高。而張文紅等[13]通過回顧821個ICSI周期得出結論：獲成熟卵數≤3是發生ICSI-TFF的高危因素。

1.3 精子異常 大量的研究發現男性不育患者的精子DNA結構和數量異常、染色體核型異常的出現的幾率比生育能力正常的男性顯著升高[14-15]。唐永梅等[15]在ICSI受精失敗的原因的綜述中提到，精子形態缺陷常伴有不成熟染色質、非整倍體、DNA碎片多、染色體結構異常，嚴重畸形的精子會降低ICSI的受精率導致不良妊娠結局。但也有研究表明畸形精子癥對ICSI的受精結局無顯著影響，少精和弱精是ICSI受精失敗的高危影響因素[13]。

1.4 ICSI技術和實驗室環境 在進行顯微注射時操作不當，例如選擇不適宜的精子、精子膜損傷不充分、未能激活卵母細胞，因損傷卵母細胞胞等都可能導致完全受精失敗。進行顯微注射操作時環境的溫度也非常重要，因為在25℃~37℃的溫度下，卵子會大量地退化、崩解，而17℃~18℃的溫度下卵子的存活率會大大提高[16-17]。

2 ICSI完全受精失敗的臨床對策

2.1 卵母細胞人工激活(artificial oocyte activation，AOA)卵母細胞人工激活是目前最常用的解決精子相關OAF的技術，應用指征：①有ICSI受精失敗史；②圓頭精子癥是指精子缺乏頂體或存在嚴重的頂體畸形，分為完全型(100%為圓頭精子)和部分型，在不育的男性患者中的發生率<0.1%；③特發性ICSI受精失敗是指既往無受精失敗病史的患者在進行ICSI操作后未能受精。AOA的方法有很多，基本原理都是增加卵母細胞內Ca2+濃度、模擬受精時的卵母細胞胞質內的生理變化[8]。一是機械激活法，是多次重復抽吸卵母細胞，通過機械刺激增加溶液中Ca2+進入細胞內的概率、破壞卵胞質中的內質網系統，從而增加內源Ca2+的釋放；二是電激活法，電激活法是通過對卵母細胞施加直流電使細胞膜產生微孔，引起溶液中的Ca2+流入卵母細胞胞質內部，需要專業的電激活設備；三是化學激活法，采用Ca2+載體處理卵母細胞[8]。采用的Ca2+載體有A23187、離子霉素(ionomycin)、氯化鍶(Srcl2)，均有文獻報道它們可改善ICSI受精率，增加妊娠率[18-19]。2015年有學者提出并非所有患者都可以受益于AOA，而是只有精子相關激活缺陷的患者才能受益，在這些懷疑卵子相關缺陷的患者中，AOA可能無法克服受精失敗[20]。AOA目前仍屬于一種試驗性質的技術，因為現有的激活方法不是自然的精子激活模式,無法確定所用的激活劑對胚胎質量、新生兒發育是否有副作用，對新生兒進行隨訪的樣本量也不足以證實其無害性，所以還需要持續的研究。

2.2 形態學選擇性單精子卵胞漿內顯微注射(intracytoplasmic morphologically-selected sperm injection，IMSI)形態學選擇性單精子卵胞漿內顯微注射是指在ICSI的準備工作中，胚胎學家根據對精子的尾部、頸部和頭部的評估，選擇一個有正常形態及活力的精子。ICSI可以識別主要的精子形態缺陷，但不能提供關于精子核狀態的信息[21]。2001年引入了活精子細胞器形態學檢測(motile sperm organellar morphology examination，MSOME)技術，MSOME與ICSI相結合就是IMSI。IMSI是指在ICSI手術之前，在至少6 000以上的總光學放大率下進行的、選擇沒有核空泡的精子，核空泡被認為與植入期間和/或植入后胚胎發育受阻有關[22-24]。因此，IMSI被提議作為常規ICSI的替代方案，用于反復ICSI失敗的夫婦及DNA片段異常的夫婦。但是IMSI在隨后的受精、胚胎發育、植入、懷孕和流產率方面的效率一直是幾項研究的焦點，并且是存在爭議的[25-26]。2018年的一篇Meta指出，單純男性因素亞組IMSI較ICSI受精率降低5%，差異無統計學意義；合并男性因素亞組IMSI較ICSI的受精率增加9%，且差異有統計學意義[27]。所以IMSI應用于ICSI-TFF的患者尚需要權衡考慮，需更多的臨床隨機對照研究進一步明確其臨床應用范圍和價值。

2.3 優化促排卵、再次促排方案 控制性超促排卵治療是進行ICSI助孕的起始環節，在治療中卵泡盡可能發育一致化，取卵時獲得的卵母細胞才與自然周期主導卵泡質量相近[28-29]。控制性超促排卵治療的目的是使患者在同一超促排卵周期募集多個卵母細胞，但多個卵母細胞同時發育，必定存在著卵母細胞發育不同步的現象。有文章提出當不成熟卵母細胞在同一取卵周期獲得卵子數的比率大于25%時，當周期的卵子受精率和臨床妊娠率就會明顯下降；卵泡液中恰當比例的雌孕激素可以促進卵母細胞的成熟，當卵泡液中10≤P/E2≤30時，卵母細胞成熟率最高[30]。卵母細胞的成熟率也受成熟卵泡比例與注射HCG的時機的影響，當HCG日成熟卵泡(≥18 mm)比例≤20%時，其卵母細胞成熟率顯著低于成熟卵泡比例>20%的患者[31]。因此，對于超促排卵治療過程中既往有較多未成熟卵的患者，應該適當延長HCG注射至取卵的時間，這樣對提高胚胎質量和妊娠率有一定幫助。獲卵數≤3個也是TFF的一個重要的危險因素，注射1~2個卵時，ICSI完全受精失敗風險高達37%，但是如果注射5個以上卵時，風險將降至0.8%；在獲卵數≤5個的周期中，患者沒有胚胎移植的風險將大大提高[32]。增加卵子和成熟卵母細胞數量，可以大大降低受精失敗的風險。對于各種原因引起的初次出現的ICSI后全部受精失敗，因為可能由于卵子質量與ICSI過程中的問題，再次促排卵后ICSI仍然是必要的治療方法。

2.4 其他的臨床對策 供精或者供卵：在現有的醫療水平下，TFF缺乏有效解決措施，選擇使用供精或者供卵是可供考慮的選擇。

3 結語

ICSI助孕周期中TFF的發生率較低，發生ICSI-TFF的原因可能是卵母細胞激活失敗、卵子質量差、精子異常、ICSI的實驗室技術和環境，目前也沒有行之有效的解決方法，臨床對策有卵母細胞人工激活、形態學選擇性單精子卵胞漿內顯微注射、優化促排卵方案、供精或供卵。發生ICSI-TFF后應結合臨床和實驗室的原因進行綜合分析，并采取相應的處理方案。